[發明專利]一種快速高靈敏檢測大田軟海綿酸毒素的試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201610268286.0
• 申請日: 2016-04-25
• 公開（公告）號: CN105785015A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 王平;邱先鑫;蘇凱麒;鐘隆潔;方佳如;田玉蘭;鄒瞿超
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/31
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種快速高靈敏檢測大田軟海綿酸毒素的試劑盒，其特征在于， 包括OA-BSA標記的可拆卸8*12的酶標板、OA系列濃度的標準品、 HRP標記試劑盒標記的OA單克隆抗體HRP-MAb、10×濃縮洗滌液、 顯色底物TMB、終止液HCl。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，OA-BSA的制備過 程為：

(1)50μg的OA粉劑溶解在50μl甲醇溶液中，得到OA溶液。

(2)將10ul20mg/ml的EDC和10ul10mg/ml的NHS加到OA溶液 中，緩慢震蕩2小時，得到活化的OA溶液，其中，EDC和NHS的 溶劑是0.1MMES，pH＝5.5。

(3)將400μl1mg/ml的BSA溶解在0.01MpH＝7.2的PBS緩沖液 中，逐滴加入活化的OA溶液中。

(4)以上混合液在震蕩條件下持續反應4小時，得到OA-BSA溶液， 同時將透析袋MW＝10000放在體積分數20％乙醇中煮沸后冷卻。

(5)將上述OA-BSA溶液用透析袋透析，透析液為0.01MpH＝7.2的 PBS緩沖液，透析液每8小時更換一次，共更換四次，得到OA-BSA 原液。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，OA-BSA標記的可 拆卸8*12的酶標板的制備過程為：

(1)包被酶標板，孵育，洗板；包被緩沖液為0.05MpH9.6的碳酸 鹽緩沖液，1L碳酸鹽緩沖液中含有1.59gNaCO₃、2.93gNaHCO₃和 0.1MNaCl；

(2)封閉酶標板，孵育，洗板；封閉液為質量分數1％的BSA溶液。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，酶標板的孵育溫度 為35℃，孵育時間為1h。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，10×濃縮洗滌液為 0.1M的PBS+1％Tween20，使用時稀釋10倍。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，標準品濃度為0、 0.2、0.5、1、2、5ng/ml。

7.一種利用權利要求1所述試劑盒檢測大田軟海綿酸毒素的方法， 其特征在于，包括以下步驟：

(1)分別將標準品和樣品加入OA-BSA標記的可拆卸8*12的酶標 板孔中，向每個孔中加入HRP-MAb，孵育，洗板；

(2)加顯色底物TMB，孵育；

(3)加終止液HCl，在450nm處測定吸光度；

(4)根據標準品的吸光度繪制檢測OA毒素的標準曲線，根據標準 曲線計算樣品中毒素的濃度。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，加入酶標板孔的樣品 的前處理過程為：取0.2g攪碎貝肉加1ml體積分數90％甲醇，渦旋 震蕩5min，7000rpm離心3min，取上清液過濾，過濾器為0.25um有 機系，稀釋10倍待檢測。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，OA-BSA100ul，封閉 液200ul，標準品和樣品分別100ul，HRP-MAb50ul，TMB100ul， HCl100ul。

10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(1)中的孵育 時間30min，步驟(2)中的孵育時間15min。