[發明專利]一種發酵培養基及用該發酵培養基發酵NMN轉移酶的方法

在審

• 申請號: 201610268173.0
• 申請日: 2016-04-27
• 公開（公告）號: CN105695429A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 李紅梅;段琳琳;袁飛飛;亢涵
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12R1/19
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 郁旦蓉

技術領域

本發明涉及微生物發酵工程領域，具體涉及一種發酵培養基及用 該發酵培養基發酵NMN轉移酶的方法。

背景技術

研究發現，NMN轉移酶廣泛存在于動物、植物、原核生物和真 核生物的細胞中。目前已經知道的NMN轉移酶在細胞中的存在形式 主要有三種亞型，分別是Nmnat1、Nmnat2以及Nmnat3，且其分子 量大小，性質以及特征隨著其在組織細胞中的分布位置不同出現差 異。煙酰胺單核苷酸(NMN)在人體細胞能量生成中扮演著重要角色， 它參與細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，細胞能量轉化的重要輔 酶)的合成。在所有活的生物組織中，NMN轉移酶是合成NAD的 不可缺少的生物酶，研究證明，它對原核生物細胞的存活十分重要， 是唯一一種能夠催化細胞核內NAD合成的生物酶，而且，NMN轉 移酶也可以作為生物藥劑的靶標，一定程度上可以降低生物細胞的衰 老和死亡，減少一些疾病的發生率。例如：可以降低由基因引起的軸 突的變性，提高抗腫瘤藥物的生物活性。

目前合成NMN轉移酶的方法主要是生物合成法，用傳統的篩選 和誘變技術可以獲得一些具有較高酶活的NMN轉移酶的菌種如金黃 色葡萄球菌、埃希式桿菌、極端嗜熱古細菌等，但是，這些菌種產酶 能力和催化能力較低，不能滿足工業發展的需求。

大腸桿菌比上述這些細菌產酶能力和催化能力都較高，并且大腸 桿菌有其最適生長培養基，而不同來源的NMN轉移酶的生成和其菌 體生長的培養基不同，因此，篩選一種既適合大腸桿菌的菌體生長又 能利于提高NMN轉移酶的培養基十分必要。

發明內容

本發明是為了解決上述問題而進行的，目的在于提供一種既適合 大腸桿菌的菌體生長又能利于提高NMN轉移酶的發酵培養基及采用 該發酵培養基發酵NMN轉移酶的方法。

本發明采用的技術方案如下：

本發明提供了一種發酵培養基，具有這樣的特征，包含：濃度為 20～30g/L的酵母粉，濃度為8～12g/L的胰蛋白胨，體積分數為 3％～4.5％的甘油，濃度為0.2～0.3g/L的MgSO₄，酵母膏，濃度為 1.0～1.5g/L的NH₄Cl，濃度為0.4～0.6g/L的NaCl，濃度為2～3g/L的 KH₂PO₄，濃度為9～13.5g/L的K₂HPO₄以及雙蒸水。

進一步的，本發明還提供了一種煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN) 轉移酶的發酵方法，利用上述的發酵培養基進行發酵，其特征在于， 包括以下步驟：步驟一，將大腸桿菌劃線接種到固體培養基上，在 37℃的條件下培養12～18h，得到含有大腸桿菌的固體培養基；步驟 二，取一定量的LB培養基溶于雙蒸水中，調節其pH值為7.0，在 121℃條件下滅菌20min，得到濃度為25g/L的活化液；步驟三，在 無菌環境下從固體培養基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終 濃度為30μg/ml的硫酸卡那霉素，在37℃條件下活化8～12h，得到含 有活化的大腸桿菌菌體的液體；步驟四，將含有活化的大腸桿菌菌體 的液體按照體積分數為1～5％的接種量接入經過滅菌的發酵培養基 中，在溫度為37℃，搖床轉速為180～200r/min的條件下，發酵培養 至OD₆₀₀為0.5～0.7時，加入終濃度為8mmol/L的誘導劑異丙基硫代 半乳糖苷(IPTG)，在溫度為25℃，搖床轉速為180r/min條件下，誘 導培養8～12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的發 酵液；步驟五，將發酵液放置于離心管中，在8000～12000r/min條件 下離心5～10min，取離心管內的沉淀得到含有煙酰胺單核苷酸腺苷 (NMN)轉移酶的大腸桿菌濕菌體。

在本發明提供的煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉移酶的發酵方 法中，還可以具有這樣的特征：其中，在上述步驟一中，固體培養基 的制備方法為：將濃度為25g/L的LB培養基和濃度為20g/L的瓊脂 用雙蒸水溶解于500ml的錐形瓶中，加入NaOH調節pH為7.0，在 121℃條件下高壓滅菌20min，得到固體培養基。