[發明專利]HQO作為監測活細胞中線粒體自噬過程熒光探針的應用

有效

• 申請號: 201610266549.4
• 申請日: 2016-04-26
• 公開（公告）號: CN105838354B
• 公開（公告）日: 2018-01-26
• 發明（設計）人: 上官棣華;柳影;周進;王林林;劉祥軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,王春霞

技術領域

本發明涉及HQO作為監測活細胞中線粒體自噬過程熒光探針的應用。

背景技術

線粒體是細胞內的發電站也是活性氧產生的主要部位，除了供給細胞能量之外也參與了很多其他的代謝過程，如鈣離子的存儲，通信及細胞分化，生長，凋亡和死亡。細胞內活性氧(ROS)量的增加會導致線粒體的氧化性損傷，同時，線粒體損傷的集聚又與細胞老化，癌癥和神經變性疾病有關。因此，保持線粒體的健康數量對細胞存活是必不可少的。損傷的線粒體或者過量的線粒體會通過自我吞噬過程被有選擇性的淘汰，以此保持線粒體的質量和數量。溶酶體是酸性的細胞器(pH 4.5-5.5)，負責廢物的處理，它們能分解各種細胞廢物，包括蛋白，核酸，糖類，脂類和細胞碎片。線粒體自噬是自我吞噬的一種，以此去除細胞內機能失調的線粒體并且依靠溶酶體方式進行成分循環。在線粒體自噬過程中，受損傷的線粒體被選擇性的隔絕成自噬線粒體，然后自噬線粒體與附近的溶酶體融合，形成自噬溶酶體(包被線粒體的自吞噬泡)，在自噬溶酶體內線粒體的成分被分解。監測活細胞線粒體自噬發生過程的探針將為線粒體代謝提供深刻的見解，也將為篩選線粒體自噬抑制或者促進劑提供有力的工具。

大部分監測自噬過程的方法都是通過抗體或者熒光蛋白標記技術檢測蛋白標志物。雖然這些方法能在分子層面檢測線粒體自噬過程，但很少有蛋白標志物能高特定性反映線粒體自噬過程。此外，基于抗體的檢測很難在活細胞內實施。線粒體或者溶酶體小分子熒光探針一起被用于探測線粒體自噬，如lysoTracker Red(LTR)and MitoTracker Green(MTG)16。基于熒光小分子的監測方法簡單，但是監測時需要同時使用兩種熒光染料分別染色線粒體和溶酶體。且溶酶體參與細胞內的吞噬作用，細胞內吞作用和自噬過程，溶酶體探針可以染色所有溶酶體，而不只是染色線粒體的自噬溶酶體。目前，并沒有同時用于檢測線粒體和溶酶體的熒光探針，也沒有可檢測包被線粒體的自噬溶酶體的熒光探針。

發明內容

本發明的目的是提供HQO作為監測線粒體自噬過程熒光探針的應用，HQO在559nm激光激發的條件下，可以特定的定位在生理學pH的線粒體。當損傷的線粒體和溶酶體融合的時候，由于新產生的自噬溶酶體的pH降低，使得HQO質子化，導致分子的激發波長紅移，可以在635nm-710nm激光的激發下定位在自噬溶酶體。

本發明提供的HQO(2,6-Bi(2-(3,3-dimethyl-1-propylindolin-2-ylidene)ethylidene)-cyclohexanone)在作為或制備具有下述1)-3)中任一項功能的熒光探針中的應用，

1)特異性標記活細胞中的線粒體自噬溶酶體；

2)同時標記活細胞中線粒體和線粒體自噬溶酶體；

3)監測活細胞中線粒體自噬過程；

其中，HQO的結構式如式Ⅰ所示：

上述的應用中，所述活細胞可為癌細胞，具體可為乳腺癌細胞MCF-7、肺癌細胞A549、宮頸癌細胞HeLa或結腸癌細胞LoVo。

本發明進一步提供了式Ⅰ所示的HQO的試劑盒在作為或制備具有下述1)-3)中任一項功能的熒光探針中的應用，

1)特異性標記活細胞中的線粒體自噬溶酶體；

2)同時標記活細胞中線粒體和線粒體自噬溶酶體；

3)監測活細胞中線粒體自噬過程；

所述試劑盒包括式Ⅰ所示化合物和溶劑；式Ⅰ所示化合物的濃度可為0.01～100mM(如1mM)；所述溶劑可為PBS緩沖液、細胞培養基(如1640和/DMEM)或二甲基亞砜。

上述的應用中，所述活細胞可為癌細胞，具體可為乳腺癌細胞MCF-7、肺癌細胞A549、宮頸癌細胞HeLa或結腸癌細胞LoVo。

本發明具有如下有益效果：

本發明克服了現有技術中需要同時使用兩種熒光染料分別染色線粒體和溶酶體來監測活細胞中線粒體自噬過程的缺陷，采用式Ⅰ所示HQO可特異性的只染色源自損傷線粒體的自噬溶酶體，且可同時定位活細胞中線粒體和線粒體自噬溶酶體，從而應用于監測活細胞中線粒體自噬過程。

附圖說明

圖1為采用IR780合成HQO的線路圖。

圖2(a)為HQO在不同酸性環境中的吸收光譜譜圖，圖2(b)為對應的結構變化圖。

圖3為HQO在DMSO中的核磁滴定氫譜。