[發明專利]一種針刺-真空滲透輔助農桿菌介導蓖麻種子的遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201610263300.8
• 申請日: 2016-04-26
• 公開（公告）號: CN105779493B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 陸建農;殷學貴;施玉珍;劉穎;李衛錦;陳旺東
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 張月光;林偉斌

本發明屬于植物基因工程轉化技術領域，公開了一種針刺?真空滲透輔助農桿菌介導蓖麻種子的遺傳轉化方法，通過蓖麻種子預培養、針刺預培養蓖麻種子的上胚軸、真空滲透將含目的基因的農桿菌菌液侵染蓖麻種子，然后共培養、菌除移栽即可；所述真空滲透是將針刺好的種子在菌液中，抽真空負壓?30～?70 kPa下處理5～20min，放空氣2～5min，再次負壓?30～?70 kPa下處理2～5min，本發明直接以預培養的種子為受體，不需要離體組織培養，該方法從蓖麻種子預培養至提取DNA檢測需要15天可獲得轉基因植株，轉化周期短，轉化率高，操作較簡單，重復性好。

技術領域

本發明涉及植物基因工程轉化技術領域，更具體地，涉及一種針刺-真空滲透輔助農桿菌介導蓖麻種子的遺傳轉化方法。

背景技術

蓖麻是世界十大油料作物之一，是特種工業油源作物和新型石油作物。蓖麻油有獨特的品質和作為“綠色石油”的可再生性能，國內外對蓖麻的研究已日益重視，并有了很大的進展。現在限制蓖麻大面積推廣發展的主要問題是病害、蟲害和蓖麻毒素等，所以培育抗病蟲害、低毒蛋白的品種是蓖麻育種關鍵，但用常規方法獲得這些新種質資源很難。隨著2010年蓖麻的全基因組測序工作已經完成，以及分子生物學和分子遺傳學的迅速發展。如果能將基因工程育種結合到蓖麻育種來，有目的的將外源基因或內源DNA導入蓖麻基因組，通過外源基因的直接表達，或通過內源基因表達的調控，從而選育出抗病、抗蟲、抗逆、高產優質的蓖麻品種，為快速培育出蓖麻新種質資源提供強有力保證。但蓖麻基因工程工作已經開展多年，有關蓖麻轉基因方面報道很少。Mckeon TA等（2003年）申請美國專利，用農桿菌介導方法把目的基因從蓖麻花蕾受傷處轉入，所結的種子經GUS基因檢測證明目的基因已轉入到蓖麻中。這種方法不用復雜儀器，操作簡單，避免繁瑣的組織培養過程，但其缺點是獲得陽性株大多數為嵌合體。Sujatha等（2005）首次以蓖麻種子的胚軸作為外植體，用農桿菌介導法將hpt和gus基因導入蓖麻受體內，經潮霉素篩選后共獲得0.08%轉化率植株。Malathi等（2006）在Sujatha建立的遺傳轉化體系基礎上，體系稍作變動，以蓖麻子葉節作為外植體，同樣采用農桿菌介導法將目的基因cry IAb導入蓖麻受體內，經潮霉素篩選后共獲得0.42%轉化率植株。Sujatha等（2009）以蓖麻胚軸作為外植體，用農桿菌介導法和基因槍法將cry 1EC基因導入蓖麻受體內，經潮霉素和卡那霉素篩選后分別獲得0.82%和0.69%轉化率植株，獲得了抗斜紋夜蛾和尺蠖的植株。Ganesh（2012）以蓖麻子葉節作為外植體，采用農桿菌介導法將GUS基因和可可的幾丁質酶基因分別導入蓖麻受體內，經卡那霉素篩選后分別獲得1.17%和1.06%轉化率植株，陽性株具有抗枯萎病特性。劉鵬（2012）以蓖麻子葉節為外植體，采用農桿菌介導法將蓖麻P450基因干涉載體導入蓖麻受體內，經卡那霉素篩選后獲得0.1%轉化率植株。黃鳳蘭等（2011年）申請專利，以蓖麻子葉節作為受體，用農桿菌介導法獲得陽性株。但上面這些技術的缺點是所需要的時間較長，離體組織培養再生難，轉化效率低，重復性差，蓖麻再生體系不能與現有的植物轉化方法更好結合。所以蓖麻轉基因的研究還缺乏深入，滿足不了開展蓖麻分子水平的研究，急需建立一種比較成熟的蓖麻遺傳轉化體系。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種針刺-真空滲透輔助農桿菌介導蓖麻種子的遺傳轉化方法。

本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：

一種針刺-真空滲透輔助農桿菌介導蓖麻種子的遺傳轉化方法，通過蓖麻種子預培養、針刺預培養蓖麻種子的上胚軸、真空滲透將含目的基因的農桿菌菌液侵染蓖麻種子，然后共培養、菌除移栽即可；所述真空滲透是將針刺好的種子在菌液中，抽真空負壓-30～-70 kPa下處理5～20min，放空氣2～5min，再次負壓-30～-70 kPa下處理2～5min。