[發明專利]一種無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液配方及其制備方法

在審

• 申請號: 201610261608.9
• 申請日: 2016-04-25
• 公開（公告）號: CN105707058A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 徐念沁;郁慶明;徐煒華
• 申請（專利權）人: 南京三生生物技術有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 翁斌

技術領域

本發明涉及一種無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液配方及其制備方法，屬于組織細胞培養技術領域。

背景技術

細胞凍存技術是細胞生物學技術中一個非常重要的手段，常規的細胞凍存液中，往往需要添加10％濃度的二甲基亞砜和人或動物源的血清或蛋白。隨著近年來干細胞治療技術和免疫細胞治療技術的發展，細胞凍存液在臨床上的使用的需求越來越大，凍存的細胞復蘇后理論上需要洗滌，去除細胞凍存液中的二甲基亞砜和其它動物源的成分，但該過程在實驗室操作起來簡便，對于臨床上的使用非常麻煩，往往二甲基亞砜被直接輸入人體。國內臨床使用的細胞凍存液中的二甲基亞砜往往使用的是國外進口的醫藥級試劑，價格非常昂貴，即使使用國外進口的高質量二甲基亞砜,在臨床上依然有很多病人會出現嚴重的副反應。臨床上對更為安全的細胞凍存液的需求非常迫切，我們在前面申報的專利，申請號為20151074667913，發明名稱為《無蛋白液氮凍存液及其制備方法》基礎上，對凍存液的配方做進一步的改進，實現在-80℃，使用無二甲基亞砜無蛋白的凍存液，可以達到高效率的細胞凍存和復蘇。新的配方為凍存液在臨床的使用帶來了便利，可以避免由二甲基亞砜給病人帶來的副作用，使用更為安全。

發明內容

本發明主要提供了一種無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液配方及其制備方法，該凍存液完全由化學成分組成配制，不含二甲基亞砜，細胞復蘇率高，穩定性好。

本發明的技術方案如下：一種無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液，其每100mL的細胞凍存液中含有6.0g的右旋糖苷、1.0～9.0g的馬來酰化的多聚賴氨酸，余量為RPMI-1640細胞基礎培養基。

優選的，所述的馬來酰化的多聚賴氨酸的修飾度為30～90％。

優選的，所述每100mL細胞凍存液中含有7.0g的60％修飾度的馬來酰化多聚賴氨酸。

本發明的另一技術方案如下：一種無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)稱取配方量的右旋糖苷，溶解于70％量的RPMI-1640細胞基礎培養基中；

(2)在上述溶液中添加配方量的60％修飾度的馬來酰化多聚賴氨酸；

(3)最后添加剩余的RPMI-1640細胞基礎培養基；

(4)在無菌條件下將上述混合液先用0.45μm濾膜進行澄清過濾，然后在無菌條件下再用0.22μm濾膜進行過濾除菌，即得到無二甲基亞砜無蛋白液氮細胞凍存液。

有益效果：

本發明的無二甲基亞砜無蛋白細胞凍存液，完全由化學成分組成配制，不含二甲基亞砜和蛋白質，細胞復蘇率高，能達到90％以上；因不添加二甲基亞砜，凍存液用于臨床上細胞的凍存，直接輸入人體，可避免由二甲基亞砜引起的副作用、同時不添加人白蛋白、動物血清等，減少了細胞感染病原的可能性。將配好的細胞凍存液采用分級過濾的方法進行制備，避免高溫消毒引起凍存液成分的破壞，被破壞的部分成分會導致細胞毒性。該凍存液的配方對細胞有極好凍存效果，同時因配方中避免使用價格昂貴的進口二甲基亞砜,生產成本更低，操作簡化。

本發明的配方中一個成分是我們依據細胞凍存的原理，用有機合成的方法獲得的高分子。然后在我們的無蛋白液氮凍存液配方基礎上做進一步的改進和優化。本發明采用有機合成的方法，合成特定的酸酐修飾的多聚賴氨酸，然后和其它不同的高分子混合，得到合適的無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液。

這種無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液的使用方法之一，具體的為，取人淋巴細胞，用細胞洗滌液洗滌后，調整至每管中含有10⁶個細胞，離心去除洗滌液，每管中加入1ml無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液懸浮細胞，于-80℃在冰箱中直接凍存。