[發明專利]含O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽的水牛卵母細胞體外成熟液及培養方法

在審

• 申請號: 201610259386.7
• 申請日: 2016-04-25
• 公開（公告）號: CN105695398A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 許惠艷;盧克煥;陸陽清;盧晟盛;楊小淦;謝龍
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于卵母細胞體外培養技術領域，尤其涉及一種含O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽的 水牛卵母細胞體外成熟液及培養方法。

背景技術

隨著胚胎生物技術的發展，相對體內來源的卵子，利用離體的卵巢獲得未成熟的卵子， 經過體外成熟培養，可獲得大量的成熟卵子，進行后續體外受精、體細胞克隆、胚胎干細 胞等的研究及生產應用。而當前水牛卵母細胞體外成熟效率較低，限制了水牛胚胎生物工 程的研究與應用。

卵子成熟及后續胚胎發育到最終胚胎附植成功，這一過程需要很高的能量。體外培養 液中添加碳水化合物對卵子完全成熟及胚胎發育起到很關鍵的作用，但最近的研究表明在 卵子成熟及后續胚胎發育中脂肪酸的β-氧化是另外一種非常重要的能量來源。在供能特 點上，脂肪酸代謝所產生的ATP是碳水化合物的幾倍，且卵子及胚胎對碳水化合物所產生 的ATP利用有限。雖然各種動物的卵子脂肪含量不盡相同，但研究表明，即使在小鼠卵子 體外成熟中，通過添加脂肪代謝的抑制劑，可抑制小鼠卵子成熟及后續胚胎發育，結果提 示脂肪代謝在卵母細胞及后續胚胎發育能力上起到至關重要的作用。

脂肪酸主要成分為甘油三酯，以滴狀被脂肪滴圍繞的形式存在于細胞質中，經脂肪酶 分解成不同長度及不同飽和度的脂肪酸，然后脂肪酸進入線粒體，進行β-氧化。

L-肉堿線粒體膜上唯一的活化的脂肪酸載體，其主要功能是攜帶、轉運活化的脂肪酸， 進入線粒體內進行β-氧化和三羧酸循環反應，為機體的各種代謝活動提供能量。在小鼠 及豬的腔前卵泡中添加L-肉堿可提高卵子的后續發育能力，但也有研究報道，在卵子成熟 中添加L-肉堿，提高了胚胎的分裂率，但對后續囊胚的形成沒有顯著的影響。

乙酰基的L-肉堿為L-肉堿的衍生物，當在需要的情況下，乙酰基L-肉堿可以很自然 的轉化為L-肉堿。有報道表明乙酰基L-肉堿比L-肉堿更具有抗氧化的能力，因此乙酰基 L-肉堿比L-肉堿可能有更有效的生物藥效率。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種含O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽的水牛卵母細胞體外 成熟液及培養方法，以提高水牛體外成熟卵子后續的發育能力及胚胎質量。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

含O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽的水牛卵母細胞體外成熟液。

O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽的濃度為2.5-5.0mM。

該水牛卵母細胞體外成熟液的組成為：溶質O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽為2.5mM，溶劑 為含NaHCO₃26.2mM，Hepes5mM，10％ECS，3％BFF，0.5μg/mlFSH，5μg/mlLH，10μg/ml Cysteine的TCM-199培養液。

使用上述含O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽的水牛卵母細胞體外成熟液進行水牛卵母細胞體 外成熟的培養方法。

上述培養方法，按以下操作進行：挑選出具有完整卵丘細胞包被的卵母細胞，先用洗 卵液洗滌2次，再用成熟液洗滌2次，然后放入含O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽的水牛卵母細 胞體外成熟液中，于38.5℃、5％的CO₂的環境內進行卵子體外成熟培養22-24h。

針對目前水牛卵子體外成熟效率低的問題，發明人研制了一種含O-乙酰基-L-肉堿鹽 酸鹽的水牛卵母細胞體外成熟液。據此，發明人還建立的相應的培養方法。試驗表明，將 O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽應用于水牛卵母細胞體外成熟，相比沒有添加O-乙酰基-L-肉堿鹽 酸鹽的水牛卵子體外成熟液，可以顯著提高水牛體外成熟卵子體外成熟質量及后續胚胎的 發育能力，且O-乙酰基-L-肉堿鹽酸鹽成本低，便于在水牛胚胎體外生產中推廣應用。