[發(fā)明專利]一種抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體及其制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610257513.X | 申請日： | 2016-04-23 |
| 公開（公告）號： | CN107304433A | 公開（公告）日： | 2017-10-31 |
| 發(fā)明（設計）人： | 不公告發(fā)明人 | 申請（專利權）人： | 北京康寶利華生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/866 | 分類號： | C12N15/866;C12N15/66 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 細胞 重組 桿狀病毒 載體 及其 制備 方法 | ||
1.一種抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體，所述重組桿狀病毒載體是把干擾昆蟲細胞caspase-1表達的小RNA的基因和調控序列敲入到桿狀病毒載體骨架上，制作出的能延長感染細胞存活期的重組桿狀病毒載體，其特征在于，所述干擾昆蟲細胞caspase-1表達的小RNA的基因是序列為SEQ ID NO.1的shRNA1、序列為SEQ ID NO.2的shRNA2和/或序列為SEQ ID NO.3的shRNA3。
2.根據權利要求1所述的抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體，其特征在于，所述的調控序列是U6啟動子序列。
3.一種抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟：
(1)擴增并克隆U6啟動子，構建表達載體pTriExU6；
(2)設計shRNA1、shRNA2和shRNA3，合成引物；
(3)用引物擴增的方法獲得shRNA的基因片段；
(4)將shRNA的基因片段克隆到表達載體，獲得表達質粒；
(5)用PCR方法擴增帶U6-shRNA基因的反篩片段；
(6)將反篩片段與AcMNPV Bacmid共轉化到含pRed/ET的大腸桿菌HS996菌株，篩選BacmidU6-shRNA；
(7)測序驗證重組病毒載體的正確性。
4.如權利要求3所述的抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體的制備方法，其特征在于，設計了三段干擾昆蟲細胞caspase-1表達的小RNA基因序列，這三段干擾RNA的基因序列為：
shRNA1:
GCTAGGATGCCAGTTGATAGATTAATAAGCTCTATCAACTGGCATCCTAGCAAAAA；
shRNA2:
GCTGTATGCCAAAGATACTCATTAATAAGCTGAGTATCTTTGGCATACAGCAAAAA；
shRNA3:
GCTAGACTTTGAGTCTAATGCTTAATAAGCGCATTAGACTCAAAGTCTAGCAAAAA。
5.如權利要求3所述的抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體的制備方法，其特征在于，選用了人的U6啟動子作為shRNA表達的調控序列。
6.如權利要求3所述的抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體的制備方法，其特征在于，用鏈霉素抗性反篩的方法，將抑制caspase-1表達的小RNA基因序列敲入到桿狀病毒載體的骨架上。
7.一種抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體，其是由權利要求3-6任意一項的方法制備得到。
8.權利要求1-2或7中任意一項所述的抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體在構建表達外源基因的重組桿狀病毒中的應用。
9.權利要求1-2或7中任意一項所述的抗細胞凋亡的重組桿狀病毒載體在蛋白藥物和疫苗生產中的應用。
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