[發(fā)明專利]一種一體式T細胞培養(yǎng)提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610253713.8
• 申請日: 2016-04-22
• 公開（公告）號: CN105670993B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發(fā)明（設計）人: 林基禎;倪華;劉力
• 申請（專利權）人: 福州創(chuàng)方醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發(fā)明涉及一種一體式T細胞培養(yǎng)提取方法，將血液標本輸入至容器內，磁珠顆粒的抗體與血液標本中的T細胞發(fā)生反應，完成T細胞的分離；將血液標本中未與磁珠顆粒反應結合的細胞經容器流出至廢液袋，同時往容器中輸入生理鹽水進行沖洗；沖洗結束后，將培養(yǎng)液輸入至容器中，磁珠顆粒上吸附的T細胞在容器中進行培養(yǎng)；T細胞在容器中擴增，將病毒轉染液輸入至容器內，進行T細胞的轉染；轉染后的T細胞在容器中進行后續(xù)擴增至特定數(shù)量；然后將T細胞從磁珠顆粒表面洗脫，輸入至一含有生理鹽水的輸液袋中供臨床使用，使得病人與病人之間的細胞在同一個空間之內互相之間沒有機會接觸和產生可能的交叉污染。

技術領域

本發(fā)明涉及醫(yī)療技術領域,特別針對外周血免疫T細胞分離、培養(yǎng)、擴增和轉染，是一種一體式T細胞培養(yǎng)提取方法，尤其針對嵌和抗原受體T細胞（CART）培養(yǎng)、自然殺傷T細胞培養(yǎng)和腫瘤特異T細胞受體T細胞（TCRT）。

背景技術

外周血淋巴細胞培養(yǎng)是一種常見的體外細胞培養(yǎng)技術，其中涉及外周血淋巴細胞的分離，一般采用FICOLL梯度離心吸取淋巴細胞層到一個培養(yǎng)皿中，或者用吸附CD3或CD28抗體的磁珠特異性吸附T淋巴細胞在磁珠表面，然后用普通培養(yǎng)皿里培養(yǎng)，用吸管吸取淋巴細胞到一個培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)是在一個開放的細胞培養(yǎng)通風廚（潔凈工作臺）中完成，空間大轉移過程容易受到空氣中的細菌病毒等微生物的污染，放在37^oC細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉染時，需要移出來放到通風廚里面換液加轉染液，然后再放回到37^oC細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，中間還需要反反復復從細胞培養(yǎng)箱里面拿出來到潔凈工作臺，又從潔凈工作臺到細胞培養(yǎng)箱中，一直到培養(yǎng)完成。臨床上CART細胞培養(yǎng)做這樣的操作程序只能一次一個病人，兩個病人在同一個細胞培養(yǎng)房內是不允許的，因為無法保證兩個病人的血細胞培養(yǎng)不互相交叉污染，因此目前臨床級別的血淋巴細胞培養(yǎng)在這種開放培養(yǎng)方式下手續(xù)煩瑣，效率低下，人力物力消耗很大，成本很高，無法大規(guī)模推廣。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是針對以上不足之處，提供了一體式T細胞培養(yǎng)提取方法，成本低，占用空間小，將細胞培養(yǎng)分離、培養(yǎng)、擴增、轉染、后續(xù)擴增和提取融為一體，避免交叉感染。

本發(fā)明解決技術問題所采用的方案是：一種一體式T細胞培養(yǎng)提取方法，其特征在于，將血液標本輸入至一密閉的容器中，所述容器容置于一密閉的37℃的保溫箱內，在所述容器中依次完成T細胞的分離、培養(yǎng)、擴增、轉染、后續(xù)擴增和提取，包括以下步驟：

步驟S1：將血液標本經容器頂部的入口輸入至容器內，容器內容置有若干個磁珠顆粒，每個磁珠顆粒上附著有用于與血液標本中T細胞或自然殺傷T細胞結合的抗體，所述抗體與血液標本中的T細胞發(fā)生反應，進行充分結合，完成T細胞的分離；

步驟S2：通過一電磁鐵將磁珠顆粒吸附聚集于容器內側壁上，將血液標本中未與磁珠顆粒反應結合的細胞經容器底部的出口流出至廢液袋，同時往容器中輸入生理鹽水進行沖洗；

步驟S3：沖洗結束后，關閉容器的出口，將培養(yǎng)液和含有空氣和CO2的混合氣體輸入至容器中，同時電磁鐵斷電，磁珠顆粒上吸附的T細胞在容器中進行培養(yǎng)，計算此時T細胞的數(shù)量為N，N為正整數(shù)，且大于0；

步驟S4：在培養(yǎng)液的作用下，T細胞在容器中擴增，待T細胞的數(shù)量大于5N時，將病毒轉染液輸入至容器內，進行T細胞的轉染；

步驟S5：轉染后的T細胞在容器中進行后續(xù)擴增至特定數(shù)量；

步驟S6：打開容器的出口，容器中的培養(yǎng)液流出至一廢液袋中；

步驟S7：將生理鹽水輸入至容器內水加力將T細胞從磁珠顆粒表面洗脫，將T細胞提取輸入至一含有生理鹽水的輸液袋中供臨床使用。