[發明專利]肉果草微衛星分子標記

有效

• 申請號: 201610251776.X
• 申請日: 2016-04-21
• 公開（公告）號: CN105713984B
• 公開（公告）日: 2020-02-07
• 發明（設計）人: 張發起;田尊哲;陳世龍;高慶波
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 11299 北京市卓華知識產權代理有限公司
• 代理人: 陳子英

本發明涉及一種肉果草微衛星分子標記，屬DNA分子標記技術領域，其通過RAD?seq技術從肉果草基因組DNA中分離微衛星分子標記，根據每個微衛星分子標記位點兩端的側翼序列設計該分子標記的特異性引物，對來自不同居群的肉果草個體進行PCR擴增并檢測擴增結果的穩定性和多態性，獲得了10個有效的微衛星分子標記。本發明開發出有效的肉果草微衛星分子標記，建立了制備肉果草微衛星分子標記的方法，并可用這些分子標記進行遺傳多樣性分析、植物遺傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析、進化與親緣關系研究等。

技術領域

本發明涉及一種生物科學中的DNA分子標記技術，尤其涉及一種肉果草微衛星分子標記、引物對及其制備方法和應用。

背景技術

微衛星分子標記又稱作簡單序列重復 (Simple Sequence Repeats, SSRs)，是指基因組中以1-6個核苷酸為單位串聯組成的核苷酸序列。由于重復次數的不同或重復程度的不完全相同，造成了微衛星序列長度的高度變異性，由此產生了微衛星分子標記。雖然微衛星位點核心序列的重復次數在個體間呈高度變異性，但是其兩端側翼序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用兩端的側翼序列設計成對引物，通過PCR技術，經聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方式顯示這些分子標記在不同個體間的多態性。微衛星分子標記具有以下特點：廣泛分布于真核生物的基因組中；多態性信息容量高；呈共顯性；遵循孟德爾遺傳法則、中性選擇等?；谝陨咸攸c，微衛星分子標記被廣泛用于遺傳多樣性分析、植物遺傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析、進化與親緣關系等方面的研究。

肉果草（Lancea tibetica），藏名巴丫巴，隸屬于玄參科肉果草屬，分布于青藏高原及其毗鄰山區（西藏、青海、甘肅、四川、云南及印屬喜馬拉雅地區等），生于海拔2000-4500米的草地、疏林中或溝谷旁。肉果草為重要的藏藥植物，全草有養肺排膿、清熱止咳功效，花、果能治療心臟病、血性腫瘤（血癌）、哮喘、痛腫瘡瘍等。肉果草藥理作用主要有如下幾個方面：（1）有抗腫瘤作用；（2）有抗氧化作用；（3）有抗瘧作用；（4）有抗真菌作用；（5）有殺菌作用；（6）具有降糖的作用；（7）具有保肝作用。由于其具有很重要的藥用價值，肉果草已經吸引了很多國內外學者的關注。在與玉樹等地的藏醫交流中發現，肉果草作為一味十分重要的藏藥材，有著較為廣泛的應用。但由于對該物種的遺傳背景等研究較少，難以開展人工種植，僅依靠野外采挖獲取，加劇了該物種的瀕危進程。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術尚未開發肉果草微衛星標記的現狀，利用限制性酶切位點相關DNA的簡化基因組測序（RAD-seq）技術開發出肉果草微衛星分子標記并獲得對應的引物，建立一種制備肉果草微衛星分子標記的方法，并由此可以進一步用這些分子標記進行遺傳多樣性分析、植物遺傳圖譜的構建、基因定位、品種鑒定、種質保存、數量性狀基因的分析、進化與親緣關系研究等。

為了實現上述目的，本發明的技術方案為：

一種肉果草微衛星分子標記，具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10中任一種或多種的核苷酸序列,這些分子標記所對應的位點分別編號為LT4、LT7、LT9、LT10、LT12、LT15、LT16、LT18、LT25、LT28。

適于本發明中任意一種或多種肉果草微衛星分子標記的特異性引物，具有序列表SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.30中任一種或多種的核苷酸序列，各引物的特點及與微衛星分子標記（位點）的對應關系見表1。

表1 微衛星片段引物的特點及與微衛星分子標記（位點）的對應關系

一種基于RAD-seq技術獲取本發明所述肉果草微衛星分子標記的方法，其包括以下步驟：