[發明專利]一種用于檢測人源性轉錄激活因子6基因表達水平的引物組合及其應用

在審

• 申請號: 201610251579.8
• 申請日: 2016-04-21
• 公開（公告）號: CN105779621A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 蔣明;于麗華;郭佳;王玏
• 申請（專利權）人: 同濟大學蘇州研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域本發明屬基因技術領域，本發明涉及一種用于檢測轉錄激活因子6基因 表達水平的引物組合。

背景技術轉錄激活因子6（ActivatingTranscriptionFactor6,ATF6）,為內質 網駐留跨膜蛋白，其內質網腔內區負責感知蛋白折疊情況，胞質區由轉錄激活結構域和含 堿性亮氨酸拉鏈的DNA結合結構域構成。內質網應激時ATF6與免疫球蛋白結合蛋白偶聯解 除，從內質網轉位至高爾基體，并被高爾基體內S1P與S2P蛋白酶先后切割，釋放出N端轉錄 激活結構域，產生活化型ATF6，誘導含有內質網反應元件的基因啟動子起始轉錄。一些重要 的內質網分子伴侶，如BIP、GRP79、PDI及一些轉錄因子XBP1、CHOP都被鑒定為ATF6的下游靶 基因。ATF6在內質網應激時介導蛋白酶解系統激活而產生保護性作用，其作為內質網上的 一種感受蛋白，是內質網應激的重要調節因子，與多種疾病的發生、發展過程相關。

帕金森病是中老年常見中樞神經系統退行性疾病,主要病理特征為選擇性黑質多 巴胺能神經元缺失及殘存神經元呈α-突觸核蛋白和泛素染色陽性的胞漿內Lewy小體。內質 網中α-突觸核蛋白的錯誤折疊堆積導致神經細胞凋亡是帕金森病的主要發病機制。Joel等 對帕金森病的研究發現，α-突觸核蛋白可抑制AT6介導的內質網應激信號通路，從而抑制內 質網應激相關的降解功能，增加細胞凋亡信號。Liu等對新生兒缺血缺氧性腦病的研究發現 內質網應激相關蛋白ATF6和Caspase-12的激活和誘導的細胞凋亡在缺血缺氧性腦損傷中 發揮重要作用。李紅玲等的研究發現轉錄因子ATF6參與對脂質轉運膜蛋白ABCA1的表達調 控，ATF6在人胚胎腎細胞HEK293內劑量依賴性地調節ABCA1基因轉錄及蛋白質表達，與內質 網應激信號通路無關；動物試驗亦顯示C57小鼠肝臟ATF6的過表達,可上調ABCA1mRNA的表 達水平。因此對ATF6表達水平相關的研究為許多疾病的研究提供了新的思路，為進一步闡 明疾病的發病機制提供了新的方法。

對ATF6表達水平的研究除采用免疫組化、ELISA和Western免疫印跡等方法從蛋白 水平進行研究外，也可從mRNA水平研究ATF6的表達水平,包括半定量反轉錄PCR和熒光定量 PCR方法等。以蛋白為檢測目標的方法通常操作比較繁瑣，耗時。半定量反轉錄PCR需要電泳 檢測，準確度不夠高。熒光定量PCR方法是一種高靈敏度、簡便快捷的檢測方法，操作簡單, 可應用SYBRgreen染料法檢測，無需使用熒光探針，設計簡單，采用熒光定量PCR相對定量 方法通過與表達水平相對穩定的管家基因比較來反映目的基因的表達水平，能很好的輔助 ATF6表達水平的研究，整個PCR反應過程只需1.2小時即可完成。細胞管家基因需選擇維持 細胞最低限度功能所不可少的、在所有細胞中均要表達的一類基因，且表達水平受環境因 素影響較小。有研究表明比較常用的actin管家基因受內質網應激影響，表達量會減少，不 適宜用于內質網應激的參考基因。核糖體蛋白基因產物是維持細胞生命活動所必須的，表 達于所有細胞中，其表達只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他 機制調節,可用作內質網應激的參考基因。

發明內容本發明通過設計人源性ATF6基因的特異性引物和核糖體蛋白RPL19基 因的特異性引物，將其用于ATF6基因表達水平的檢測。本發明的工作原理是應用熒光定量 PCRSYBRgreen熒光染料的方法根據相對定量原理，即2^-△△CT法確定基因表達水平。

本發明包含兩套引物系統，一套引物是針對人源性ATF6基因的特異性引物；另一 套引物是針對人的核糖體蛋白RPL19基因設計的特異性引物。

根據NCBI公布的humanATF6mRNA序列（序列號：NM_007348.3）設計ATF6引物序列 見表1：

表1.ATF6引物設計