[發(fā)明專利]一種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610251264.3
• 申請日: 2016-04-21
• 公開（公告）號: CN105713886A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 解孝滿;程仕偉;吳府勝;韓彪;李文清;張萍
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省林木種質(zhì)資源中心
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/79
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李素紅

1.一種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法，其特征在于它包括如下步驟：

(1)粗酶制備：淡紫擬青霉YT08發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心5min，去除 菌體后收集保留上清液，然后再經(jīng)微孔過濾膜過濾除淡紫擬青霉YT08菌體， 即為粗酶液；

(2)淡紫擬青霉殼聚糖酶純化：在步驟(1)獲得的粗酶液中加入固體硫 酸銨至30％的飽和度，4℃冰箱冷藏靜置5～10h后，離心去除雜蛋白，并收集 上清液；離心去雜蛋白后的上清液上再加入固體硫酸銨至80％的飽和度，4℃冰 箱冷藏靜置過夜，離心，收集沉淀；用pH5.0的0.2mol/LHAc-NaAc緩沖液 溶解沉淀，在透析袋中透析除鹽，透析后的酶液經(jīng)PEG4000濃縮后經(jīng)Sephadex G-100柱層析純化，用0.2mol/LpH5.0HAc-NaAc緩沖液洗脫，流速在0.5～1 mL/min；檢測每管酶液的酶活力和蛋白含量，合并酶峰部分的酶液，最后經(jīng) PEG4000濃縮，即得純化后的淡紫擬青霉殼聚糖酶，冷凍干燥后制得固態(tài)淡紫 擬青霉殼聚糖酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法，其特征在于 淡紫擬青霉殼聚糖酶粗酶液的制備方法：

(1)菌種活化：取保存淡紫擬青霉YT08菌種接種于活化培養(yǎng)基中，在 28℃、200rpm下培養(yǎng)至菌體渾濁，制得活化種子液；

(2)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶：按照0.2～0.8％(v/v)的接種量在滅菌后的發(fā) 酵培養(yǎng)基中接入步驟(1)活化種子液，在180rpm的旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)，控制溫 度為30～34℃，發(fā)酵3-5d后培養(yǎng)完畢，發(fā)酵液經(jīng)離心過濾除菌后直接作為殼 聚糖酶液使用；或者在發(fā)酵罐中以70％的體積比例裝入發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)118℃ 蒸汽滅菌20min后，按照0.2～0.8％(v/v)的比例接入活化的菌種，控制發(fā)酵 過程中的pH始終維持在pH5～6.5，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在30～34℃，溶解氧維持 在10％(mg/ml)以上，經(jīng)發(fā)酵2-4d后發(fā)酵完畢，經(jīng)離心過濾除菌后直接作為 殼聚糖酶液使用。

3.一種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法，其特征在于所述的活化培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，pH7.0，121℃滅 菌20min備用。

4.一種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：甘油10～20，大豆蛋白胨20～35，MnSO₄0.5～2.5，脫乙酰度85％以 上的粉末殼聚糖12～20，NaCl2.5～4，CaCl₂0.5～1.5，MgSO₄1.5～3.5， FeSO₄0.5～2，pH5～6.5。