[發明專利]一種新型作物特異啟動子分離方法

有效

• 申請號: 201610247623.8
• 申請日: 2016-04-18
• 公開（公告）號: CN107304421B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 魏鵬程;楊劍波;李娟;李浩;楊亞春;李莉;許蓉芳
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙) 11457
• 代理人: 黃云鐸

本發明提供一種新型作物啟動子分離方法，所述方法利用作物不同品種在長期的馴化過程中，其啟動子上堿基的多態性可能通過改變啟動子活性影響基因表達，從而產生性狀差異的原理，以作物不同表型的品種為材料，綜合轉錄組和基因組深度測序數據，以生物信息學手段批量分離與表型差異相關的、具有核酸多態性的特異型啟動子，再通過連接報告基因的實驗進行鑒定，獲得一批與關鍵性狀調控相關且具有生理表達強度的新型啟動子。本發明對品種資源加以創新利用，拓寬了作物啟動子研究的范圍，且所分離的啟動子與性狀差異直接相關，表達強度更可能是生理上需要的強度，同時啟動子可在不同作物背景下保持特異性，更適于基因工程的使用。

技術領域

本發明涉及到生物技術和植物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及大規模分離鑒定作物啟動子的方法。

背景技術

啟動子是轉基因的重要元件，直接決定了轉入基因的作用效果和利用效率。在基因工程中，為了同時達到有效性狀改良和減少能量損失的目的，使用合適強度且具有時空或環境特異性啟動子是最具可行性的技術路線。而該技術的前提是建立包含較多不同表達強度和表達特性的內源啟動子。在作物中，特別是水稻中，啟動子的研究遠落后于基因的研究。有限的啟動子研究更多的著眼于解釋其驅動基因的功能，而對于特異性和強度這兩個基因工程應用重要指標的鑒定卻相對較少。因此大規模篩選克隆系列不同表達強度同時具有嚴謹特異型的植物啟動子在作物轉基因品種改良的研究和實踐中具有重要意義。

啟動子的批量分離鑒定手段十分有限。傳統方法中，利用功能基因組學研究所構建的啟動子陷阱或增強子陷阱類水稻T-DNA插入突變文庫，即構建一個無啟動子的報告基因表達載體，只有該載體在插入到染色體基因啟動子下游并臨近轉錄位點且方向正確時，才能在染色體基因啟動子的指導下表達，才會有報告基因和被捕獲的內源基因上游編碼區的融合轉錄，從而發現、分離和研究啟動子及其相關基因。該方法能獲得一些啟動子，但也存在一些缺點，如易出現重復捕獲現象，成功率低，而且這種方法前期投入巨大，所得啟動子表達特征隨機性較大，序列結構不明確，需要繁雜的分離和驗證工作；且受轉基因插入頻率的制約，無法充分的挖掘天然資源。通過生物信息學手段挖掘轉錄組數據是提高特異性啟動子和調控元件研究能力的思路，2008年后，在水稻和擬南芥中已有報道通過分析基因芯片表達數據，定向預測并分離鑒定到一組具有組織和誘導特異性的啟動子。但這樣的方法在研究環境誘導啟動子時，所使用的轉錄數據多是在極端的處理條件下收集，篩選基因的誘導強度可能并不與水稻耐逆性直接相關。雖然分離的啟動子活性在極端環境下常常達到甚至高于組成型啟動子35S或ACTIN的強度，但在耐逆生理過程中的表達強度卻并不確定。因此，在基因工程中，這些啟動子可能并不能最大程度發揮所驅動耐逆基因的效率。此外，目前所分離啟動子序列均來自于已測序品種，比如水稻中大部分啟動子來源于日本晴，日本晴與實際應用的水稻品種存在一定的遺傳差異，因此日本晴啟動子在需進行遺傳改良的背景材料中是否具有高度保守的表達能力還存在疑問。

因此，雖然現有技術中給出了少量獲取啟動子的方法，但是現有方法均存在其局限性或難以彌補的缺陷，目前還沒有一種能夠高效地批量進行啟動子分離的技術。

發明內容

本發明希望提供一種高效的、大規模高效分離作物中各種未知啟動子的方法。

本發明主要是基于這樣的思路：數千年的馴化歷史，使作物具有豐富的與農業性狀相關的遺傳多樣性。這些遺傳多樣性主要是由其基因組上堿基的多態性(單個堿基變異、片段重復、缺失、插入)等決定的。這些多態性既會出現在基因序列上，也會出現在啟動子上。大量的研究已經表明，基因序列上的堿基多態性影響了其功能從而產生了表型的變化。對于啟動子序列的多態性，雖然研究較少，但普遍認可這些SNP(單核苷酸多態性)或片段插入缺失可能通過改變啟動子活性影響基因表達，從而產生性狀的差異。以此為理論基礎，本發明擬以不同表型品種為材料，通過綜合轉錄組和基因組深度測序數據，以生物信息學手段批量分析分離與表型差異相關的、具有核酸多態性的特異型啟動子，再通過連接報告基因的實驗驗證，鑒定獲得一批與關鍵性狀調控相關且具有生理表達強度的新型啟動子。