[發明專利]扁桃擬莖點霉TaqMan熒光定量PCR引物及探針

有效

• 申請號: 201610244771.4
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105671196B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 張華;胡白石
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國無錫出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 曹祖良;劉海

本發明涉及一種扁桃擬莖點霉TaqMan熒光定量PCR引物及探針，其特征是：所述引物包括SEQ ID No：1所示的上游引物histone H3?F和SEQ ID No：1所示的下游引物histone H3?R組成的引物對。所述用于檢測扁桃擬莖點霉的探針，包括SEQ ID No：1所示的探針histone H3?P。所述探針histone H3?P的5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光猝滅基團TAMRA。所述檢測扁桃擬莖點霉的方法，其特征是，包括以下步驟：（1）合成上游引物histone H3?F、下游引物histone H3?R和探針histone H3?P，并對探針histone H3?P進行標記；（2）提取待檢測樣品的基因組DNA，以上游引物histone H3?F和下游引物histone H3?R進行擴增，得到擴增產物；（3）采用熒光定量PCR檢測體系對待測樣品進行檢測。本發明適用于扁桃擬莖點霉Taqman熒光定量PCR檢測，快速、靈敏、簡便。

技術領域

本發明涉及一種扁桃擬莖點霉TaqMan熒光定量PCR引物及探針，屬于生物技術領域，適用于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。

背景技術

扁桃擬莖點霉（無性態：Phomopsis amygdali，有性態：Diaporthe amygdali）是重要的植物病原菌，對桃、紅葉李、花梅、梨和杏等多種薔薇科植物均有致病性，但在桃樹上引起的桃縊縮潰瘍病尤為嚴重。常表現為在桃樹新梢嫩枝的基部形成環狀褐色病斑，致使枝條病部以上葉片快速枯萎脫落，病害蔓延擴展迅速，可造成20~50%的產量損失，嚴重的致使桃樹整株死亡。自1905年起，Delacroix等首次報道了法國發生桃樹潰瘍病之后，意大利、美國、日本等地也相繼發現該病。在中國，桃潰瘍病出現的相對較晚，直到20世紀80年代后期才有有關該病發生流行的報道，并且起初該病只在遼寧、云南、山東、河南的局部地區發現，危害范圍較小。2008年之后，桃潰瘍病在江蘇無錫、常州和浙江嘉興等我國南方桃區相繼發生且逐年加重。尤其在2013年，江蘇無錫桃潰瘍病大暴發，給當地桃產業造成了嚴重的損失，嚴重影響了桃農生產的積極性，已逐漸成為阻礙我國桃產業持續健康快速發展的重要因素之一。

對于扁桃擬莖點霉進行早期檢測可以及時采取防治措施，控制病害的進一步擴展。目前，扁桃擬莖點霉的檢測技術主要為傳統檢測法和常規PCR檢測方法。傳統檢測法是對病健交界處進行組織分離培養，觀察病原菌形態、培養性狀并回接到寄主植物觀察致病性的過程，但其費時費力，不適合病害的早期檢測。隨著分子生物學的快速發展，戴富明等將常規PCR檢測法引入到桃潰瘍病病菌的檢測中，靈敏度達到100 fg/L，且花費時間短，檢測效率高。

TaqMan熒光定量PCR法是在常規PCR的基礎上，增加1條雙熒光標記的特異性核酸雜交探針，通過檢測熒光信號強弱來監測PCR反應過程中擴增產物量的變化。與常規PCR相比熒光探針雜交信號不需經過瓊脂糖凝膠電泳，有效避免了交叉污染和假陽性的產生，具有省時省力、靈敏度高、特異性強、重復性好及病原定量等優點，已成為病原定量檢測的重要方法。張甜甜等將表現植原體癥狀的野豌豆植株同時進行巢式PCR和熒光定量PCR檢測，結果顯示巢式PCR檢測時有目的條帶，但測序分析并非植原體，這與熒光定量PCR檢測中未發現熒光信號的增加結果相符。王恒波等利用熒光定量PCR法對甘蔗宿根矮化病菌（Leifsonia xyli subsp. xyli）樣品進行檢測，結果顯示熒光定量PCR陽性檢出率達到常規PCR檢出率的兩倍。以上研究表明，熒光定量PCR法能夠提供較常規PCR更高的專化性和靈敏度。迄今，尚未有利用TaqMan熒光定量PCR方法對扁桃擬莖點霉進行檢測的報道。