[發明專利]一種構建mRNA5’端信息文庫的方法

有效

• 申請號: 201610242527.4
• 申請日: 2016-04-19
• 公開（公告）號: CN105734052B
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 吳啟家;黃冉;余鳳云;陳棟
• 申請（專利權）人: 武漢生命之美科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

本發明屬于基因組學技術領域，具體涉及一種簡化CAGE?seq建庫方法。本方法采用富集含帽子結構的mRNA及lncRNA，并特異性加上5’端接頭，片段化處理后，進行逆轉錄，進一步富集5’端信息。整個方法中糅合了現有成熟gnomegen公司RNA?seq kit。本方法操作更簡單、成功率高，也能特異性富集5’端信息，對于鑒定整個細胞內mRNA的轉錄起始位點，從而獲得準確的啟動子信息和5’UTR信息更有幫助。是研究基因表達的有力方式，適用與基因調控網絡研究。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種構建mRNA5’端信息文庫的方法。

背景技術

基因的表達調控最主要的方式是轉錄調控，即啟動子順式作用元件與轉錄機器互作的調控。位于轉錄起始位點(TSS)上游的核心啟動子包含了與轉錄機器互作的最主要的作用元件，因此啟動子的準確鑒定對研究基因表達調控至關重要。不同的轉錄起始位點，會導致基因使用不同的5’UTR。5’UTR對mRNA的翻譯起始至關重要，是翻譯效率調控的最主要靶標區域之一。絕大多數基因都有2個以上的轉錄起始位點，系統鑒定mRNA的轉錄起始位點，一方面可以鑒定核心啟動子元件，另一方面可以確定mRNA的5’UTR，是研究基因表達的有力方式，適用與基因調控網絡研究。

最早人們研究5’UTR序列信息，是采用5’RACE方法(B.C.Schaefer Volume 227,Issue 2,May 1995,Pages 255–273)，但是通量較低，構建克隆耗時較長。第1個高通量獲得轉錄起始位點預測方法是帽分析基因表達法(CAGE)，該方法是由最早的Sanger測序法發展而來的，并能通過cDNA克隆獲得完整的RNA帽子結構。該方法雖然對轉錄起始位點的預測有效，但需要大量高質量的RNA并且獲得的轉錄起始位點很短，僅是20～21個核苷酸長度。

通過高通量的二代測序技術(NGS)發展，CAGE方法得到改進，經研究發現，通過該方法可以獲得整個基因組范圍內復雜的轉錄起始位點分布和獨特的啟動子。CAGE與RNA測序技術結合后衍生出了以CAGE策略為基礎的DeepCAGE法、CAGEscan法(如圖1)、nano-CAGE法(如圖2)、以及PEAT法。nanoCAGE法解決了CAGE法需要大量RNA的缺點，可以通過放大技術從10ng的總RNA量獲得轉錄起始位點的映射。PEAT法和CAGEscan法雙末端測序可以獲得轉錄起始位點映射以及轉錄起始位點下游區間，具有良好的連通性并能促進識別特殊的轉錄本；此外，雙末端測序緩解了對單個短讀取重復區的校對，通過RNA測序可以獲得序列的重復特性。盡管這些方法結合了NGS技術，克服了一些CAGE方法的不足，但存在一定的弊端，例如，nano-CAGE法擴增循環數較多，易引入偏好性；在檢測擴增結果過程中的有些操作步驟，可能影響了轉錄起始位點出現的頻率；沒有特異性，編碼RNA和非編碼RNA都可以鑒定；而且這些技術步驟多、不易操作。

發明內容

為了解決現有技術中存在的不足，本發明提供一種CAGE-seq測序文庫的構建方法，其包括如下步驟：

1)用DNaseI處理RNA樣品，獲得無DNA污染的RNA；

2)富集含polyA尾巴的mRNA，將富集到的含5’端帽子結構的RNA進行去帽子結構，加5’接頭，所述的5’端接頭是gnomegen公司的RNA-Seq Library Preparation Kit forWhole Transcriptome Discovery，貨號為K02421中提供的，然后片段化處理樣品；

3)使用隨機引物對片段化處理的樣品進行逆轉錄，合成cDNA；

4)采用步驟2)的gnomegen公司試劑盒中的PCR體系，試劑盒中與5’端接頭匹配的引物，進行PCR擴增，得到CAGE-seq測序文庫，只有5’端連接有接頭的序列，才能擴增出文庫。

上述步驟2)具體包括：