[發明專利]一種基于RNAi的轉基因西瓜新材料創制

在審

• 申請號: 201610239420.4
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN107267553A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 郝興安;趙磊;吳云鋒
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及一種適合雙子葉植物遺傳轉化、高抗西瓜花葉病毒病的RNA干涉載體的構建及其在西瓜遺傳轉化中的應用。進一步涉及西瓜eIF4E基因及其同源異構體eIF(iso)4E基因的表達載體及其遺傳轉化西瓜并得到轉基因植株。

技術背景

我國西瓜(Citrullus lanatus)栽培面積世界第一，年平均種植面積為120萬hm²。以西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)為代表的西瓜病毒病是西瓜等葫蘆科作物生產的主要限制因子，西瓜病毒病常年發病面積達10萬hm²，因其危害嚴重，常造成巨大的經濟損失，年經濟損失達1.5億元。西瓜花葉病毒為馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員。WMV病毒基因組為單鏈正義RNA，5’末端結合有病毒基因組編碼的蛋白(Viral protein genome-linked，VPg)，3’末端為多聚腺苷酸尾。該RNA先翻譯成一大的多聚蛋白，再通過自身編碼的蛋白酶將多聚蛋白加工成有功能的蛋白。

傳統的瓜類病毒病防治方法主要有(1)控制傳毒介體；(2)選育抗性品種；(3)病毒交互保護。通過控制蚜蟲傳毒介體來防治病毒病，雖然在生產上有一定的作用，但是由于蚜蟲易繁殖，易產生抗藥性而限制了其應用。選育抗性品種是最有效、最持久的病毒病害控制策略。然而，由于已發現的病毒抗性資源難以轉育，顯著制約了抗病育種工作的研究進展。交互保護雖然在國外有報道用于防治ZYMV、CMV等病毒，但是國內目前還沒有應用弱毒株系防治葫蘆科作物病毒病的報道。

隱性抗性基因在抗病毒植物中普遍存在。主要的機制是通過缺失或突變一些對病毒在植物體內生存起至關重要作用的寄主因子，從而達到使病毒在寄主體內不能增殖的作用。目前，從多種作物中已克隆到了相當數量的隱性抗性基因，鑒定表明這些基因多屬于真核細胞翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIF)的eIF4E和eIF4G家族。eIF4E廣泛存在于植物、哺乳動物、果蠅和線蟲中。植物中分離到2種不同的復合物，eIF4E及其同源異構體eIF(iso)4E。瓜類中eIF4E和eIF(iso)4E都各是由一個基因編碼。eIF4E在植物與病毒互作中發揮極其關鍵的作用。植物中eIF4E具有VPg結合的能力，促進其在寄主中復制與侵染。有研究表明馬鈴薯Y病毒屬病毒VPg蛋白或者其前體與eIF4E或者eIF(iso)4E直接相互作用，這是病毒感染的必要條件。

由于eIF4E在病毒侵染中的重要作用，通過尋找eIF4E突變體來發現隱性抗性基因，已成為提高植物病毒抗性的重要策略。但是，在瓜類中至今還沒有找到相應的突變體。為此，通過對植物自身eIF4E的干擾，沉默其基因表達，破壞eIF4E與病毒VPg之間的互作，阻斷病毒的復制與傳播途徑，從而使植物獲得相應的病毒抗性，成為培育具有病毒抗性西瓜植株的重要策略。

RNAi是由RNA介導的通過特異性的相互作用來抑制基因表達的遺傳干涉技術，它能夠特異、有效地降解mRNA，從而引起轉錄后水平的基因沉默。近年來，RNAi技術在研究植物病毒基因功能與致病機制和植物抗病機理中有了廣泛應用，但是多數研究限定于對病毒基因的沉默，而通過RNAi技術對寄主基因進行沉默，使其失去介導病毒侵染的能力，從而使植株獲得病毒抗性，尤其在西瓜抗病毒病研究方面，目前還未見報道。

發明內容

針對上述不足，本發明克隆了西瓜eIF4E基因及其同源異構體eIF(iso)4E基因，并設計了西瓜eIF4E基因及其同源異構體eIF(iso)4E基因連接片段4E-iso介導的dsRNA前體結構，分別采用4E-iso片段插入到干涉載體pCAMBIA1301的正義鏈和反義鏈位點，重組構建了適合西瓜遺傳轉化的RNAi干涉載體。將含有目的基因片段的重組RNAi載體轉化農桿菌AGL-1菌株，然后利用農桿菌對西瓜進行遺傳轉化操作，將目的基因片段插入到西瓜染色體中。在西瓜植株內，通過構建的重組載體莖環結構，形成發卡RNA，作為dsRNA的存在形式激發PTGS反應，從而降解與插入的目的基因片段具有同源性的西瓜eIF4E基因及其同源異構體eIF(iso)4E基因，破壞其對病毒侵染的介導作用，使植株獲得對WMV的病毒抗性，最終實現利用RNAi技術沉默寄主體內病毒侵染關鍵因子，培育具有病毒抗性的西瓜新材料的預期目標。

本發明的目的是通過如下技術方案實現的：