[發明專利]轉基因抗蟲玉米HGK60外源插入片段的旁側序列及其檢測方法

有效

• 申請號: 201610237095.8
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105779610B
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 郎志宏;黃大昉;汪海;朱莉;李圣彥;宋苗;李秀影;戴軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

本發明涉及轉基因抗蟲玉米HGK60外源插入片段的旁側序列及其檢測方法，屬于生物技術領域。本發明構建了含有Bt cry1Ah基因的植物表達載體pmAhG2，得到了轉有Bt cry1Ah基因的轉玉米植株，篩選到一個抗玉米螟效果顯著的轉基因事件HGK60；HGK60玉米事件在其基因組第一號染色體上包含有插入基因序列及在玉米基因組的5’側翼序列和3’側翼序列，分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。可以根據導入玉米的插入序列和側翼序列的結合區DNA設計引物，特異性地定性、定量檢測HGK60事件。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及轉基因抗蟲玉米植物的檢測。

背景技術

玉米(Zea mays L.)是重要的糧食作物、飼料和工業原料，在國民經濟中起著十分重要的作用。蟲害一直是制約玉米產量的重要因素之一，全球范圍內玉米害蟲約350種，其中以鱗翅目玉米螟危害最為嚴重，分布最廣。在我國玉米螟危害從北向南一年可發生1～7代，一般年份春玉米受到玉米螟的危害可造成玉米減產10％左右，大發生年所造成的產量損失嚴重時可達30％以上。同時鱗翅目害蟲對玉米穗發生侵害時，會產生真菌毒素，對牲畜的健康造成很多不良的影響，并且該毒素被懷疑可導致癌癥。因此，有效地防治蟲害對我國乃至全世界的農業生產具有非常重要的意義。

傳統的病蟲害防治方法主要包括化學防治和生物防治。化學防治殺蟲譜廣，見效快，應急性強，操作方便，但長期噴灑會導致嚴重的生態問題，包括害蟲產生抗藥性，對環境造成污染，對人體健康造成嚴重危害，毒害害蟲的天敵及有益的昆蟲等諸多弊端。生物防治是從生態角度尋求的一種方法，相對安全，減輕了環境污染，但其見效慢，受環境影響較大。抗蟲轉基因技術的發展對植物自身抗蟲性的提高有十分重要的意義，為蟲害的防治提供了一條新的途徑。自1996年第一例轉Bt基因抗蟲玉米在美國被批準商業化種植以來，全球抗蟲轉基因玉米的種植面積逐年增加。

轉Bt基因抗蟲玉米的研發工作，在國外起步較早并且發展十分迅猛，如孟山都公司推出的“MON810”抗蟲玉米和Syngenta公司推出的“Bt176”和“Bt11”抗蟲玉米已產業化推廣，它們都是以玉米螟為防治對象的轉Bt cry1Ab基因的抗蟲玉米；隨后迪卡公司推出了轉Bt cry1Ac基因抗蟲玉米“DBT418”，Aventis CropScience公司和杜邦先鋒公司分別推出了轉Bt cry9C基因抗蟲玉米“CBH351”和轉Bt cry1F基因抗蟲玉米“TC1507”，其防治對象主要是玉米螟。國內的抗蟲玉米研究起步比較晚，發展也相對比較緩慢，到目前為止尚無產業化的轉Bt基因的抗蟲玉米品種。丁群星等和王國英等(丁群星等，中國科學B輯，1993，23(7)：707-713；王國英等，中國科學B輯，1995，25(1)：71-76)分別利用子房注射法和基因槍轟擊法將Bt基因導入玉米中，獲得了轉Bt基因再生玉米植株；王罡和杜娟(王罡等，玉米科學，2002，10(1)：36-37)用花粉管道法將Bt基因導入玉米進行研究并獲得了轉基因植株；朱常香等(朱常香等，山東農業大學學報：自然科學版，2002，33(2)：120-125)采用共轉化法將Btcry1Ab基因和bar基因轉入玉米幼胚中，部分轉基因植株對玉米螟表現出一定的抗性。

Bt cry1Ah基因是中國農業科學院植物保護研究所張杰研究員課題組是從國內蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中分離克隆的一個新型殺蟲蛋白基因(專利號：2004 1 0009918)。該基因的編碼區為3549bps，編碼1182個氨基酸，分子量為134kDa。Cry1Ah蛋白對鱗翅目害蟲具有高毒力，對棉鈴蟲、水稻二化螟的殺蟲活性強于Cry1Ac蛋白；對亞洲玉米螟的殺蟲活性強于Cry1Ac、Cry1Ab蛋白。對Cry1Ah活性區的研究表明，自ATG至2001bp共667個氨基酸的多肽片段(65kDa)同樣具有高毒力，是活性必需區段，對玉米螟、棉鈴蟲、小菜蛾和二化螟的殺蟲活性與全長Cry1Ah蛋白相當(Xue et al，FEMSmicrobiology letters,2008，280(1):95-101)。