[發明專利]一種檢測生物樣品中結核分枝桿菌的免疫檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201610235208.0
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105759038A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 肖樂義;張賀秋;米明仁;馮曉燕;陳立敏;楊勤英;譚印成;陳鳳華
• 申請（專利權）人: 肖樂義
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于醫學免疫診斷學技術領域，具體而言，本發明涉及一種檢測生物樣品中結核分枝桿菌的免疫檢測方法以及試劑盒。

背景技術

結核病是由單一病原體結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。近年來，由于人口流動性的增加、耐藥結核的出現、結核菌與艾滋病病毒的雙重感染等因素，結核病又卷土重來，再次成為嚴重危害人民群眾身體健康的重大公共衛生問題和社會問題。據世界衛生組織（WHO）報道目前估計全球大約有20億人感染結核分枝桿菌，2013年新發病例900萬。我國是結核病的高負擔國家，結核病患者數量居世界第二位，年發病人數約為130萬，占全球發病人數的14%。

結核病是一種異質性非常高的疾病，機體感染結核分枝桿菌后有人很快發病，成為活動性結核病患者，有人則終生不發病，成為潛伏感染者；結核病患者表現形式也多種多樣，有的表現為肺結核，有的則表現為不同類型的肺外結核，這種異質性嚴重阻礙了結核病的預防、治療、以及診斷的研究進展。

目前常用的結核分枝桿菌檢測方法有很多種，主要包括傳統細菌學檢測技術、免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術，它們各有特點，但往往存在操作復雜、耗時長、假陽性率高或假陰性率高等缺陷。

(一)傳統細菌學檢測技術

痰結核分枝桿菌陽性是診斷肺結核病的金標準，檢查方法有痰涂片法和痰培養法。

1、痰涂片法是從患者呼吸道取得的痰液標本進行涂片，再進行染色，然后在顯微鏡下鏡檢，如果痰中有細菌容易被檢出，也可以粗略地分辯是哪一類或哪一種細菌。所以痰涂片檢查是一種簡便、快速、價廉、可以得到初步結果的常用檢查方法。但是，臨床結果證實痰涂片法陽性率低，約30-40%，且需要痰標本中的細菌≥10⁴/mL才能檢出，敏感性低，特異性較差。為了提高檢出率，后來有人將其改良，利用離心沉淀集菌涂片，將約5mL痰液中所含結核分枝桿菌的大部分濃縮到0.1mL沉淀中，使其靈敏度有所增高，但仍然不能解決特異性的問題，不能滿足臨床需求。但是，由于其操作簡單，不需要昂貴的設備和高水平的實驗條件，適合于衛生技術條件欠發達地區的技術人員使用，所以，盡管涂片法陽性檢出率不高，仍然是基層單位普遍使用的結核菌檢測方法。

2、痰培養法是為了準確地獲得具體是什么細菌，用人工的方法讓其生長，以便于觀察，并可以利用培養菌做藥物敏感試驗，避免盲目地使用抗生素，使患者更早得到有效治療。痰培養與痰涂片相比更準確可靠，但需要相對較長的時間，一般需要2-4周。痰培養法耗時較長且陽性率低，一般在50-60%左右，對臨床早期診斷價值有限，還需要做胸片、肺CT、支氣管鏡檢查以及結核抗體等檢查來輔助診斷。

3、痰涂片和痰培養中痰標本的采集至關重要，痰標本質量的好壞、送檢及時與否等因素都將直接影響檢測結果。

綜上，傳統細菌學檢測方法存在以下三方面的缺點：

第一，基于患者痰樣本進行檢測，患者痰的有無、采集方法是否正確、質量好壞、送檢及時與否等因素都將直接影響檢測結果，從而導致基于痰樣本的細菌學檢測無法獲得更高的檢出率和更好的特異性，迄需新型檢測方法替代傳統痰菌檢測。

第二，肺結核患者占全部結核患者的80%，其中將近50%是痰菌陰性的患者，通過傳統痰菌細菌學檢測勢必會造成這部分人群的漏診，需要其他方法輔助診斷；另外大約20%的結核患者表現為肺外結核，無法獲得痰樣本，因此也無法得到明確的細菌學證據，只能借助其它方法輔助診斷，或者試探性抗結核治療，迄需適合菌陰及肺外結核的新型細菌學檢測方法。

第三，目前對于抗結核治療是否治愈的評價，WHO同樣推薦以細菌學指標為判斷標準，因此，對于痰菌陽性的肺結核病人，在預定療程最后2個月連續痰菌培養陰性，即為陰轉治愈。而對于痰菌陰性的結核病人，在完成預定療程后，痰菌仍然為陰性者，即為滿療程治愈。但是，一般痰菌陽性患者在治療兩個月后均無法獲得痰樣本，而體內細菌是否清除卻不得而知；而痰菌陰性患者這一直表現為陰性，無法真正判斷是否治愈。所以，以痰菌培養結果作為治療效果評價的標準，勢必造成治療不徹底或者過治現象。

(二)免疫學檢查

Nassau等首次利用酶聯免疫吸附試驗在結核患者血清檢測到結核抗體，由此開啟了結核免疫學檢測的新紀元，目前結核病免疫學檢測成為結核病輔助檢測重要手段之一。

1、抗體檢測