[發明專利]一種基于IgE線性表位多克隆抗體定量檢測過敏原β-乳球蛋白及其致敏性殘基的方法

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• 申請號: 201610234926.6
• 申請日: 2016-04-18
• 公開（公告）號: CN105785047A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 陳紅兵;何圣發;李欣;高金燕;楊安樹;佟平;吳志華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

1.一種基于IgE線性表位多克隆抗體定量檢測過敏原β-乳球蛋白及其致敏性殘基的方法，其特征是按以下步驟：

（1）以牛乳β-乳球蛋白為抗原，通過常規方法獲得β-乳球蛋白多克隆抗體；

（2）CNBr-Sepharose4B柱材與β-乳球蛋白偶聯，制備免疫親和柱；抗血清與等體積的PBS混合，將血清緩慢加入Sepharose4B親和柱中，室溫下孵育30min，再循環上樣一次；用20倍柱體積的PBS進行非特異性洗脫，再用10倍柱體積的3MMgCl₂進行特異性洗脫得到β-乳球蛋白特異性多克隆抗體；純化后，用截留分子量為3kDa的超濾管對抗體進行除鹽，并濃縮至合適的體積；

（3）以β-乳球蛋白肽段AA1~8、AA31~48、AA47~60、AA67~78、AA75~86、AA127~144和AA141~152為B細胞表位，并依次編號B1、B2、B3、B4、B5、B6和B7，以β-乳球蛋白肽段AA77~97為T細胞表位，T細胞表位位于串聯體N端，B細胞表位位于串聯體C端，用兩個賴氨酸連接T細胞表位與B細胞表位，用一個甘氨酸連接相鄰的兩個B細胞表位；通過DNAStar軟件對不同組合串聯體的抗原性、表面可及性及親水性進行分析，使每個表位的抗原性和親水性大于0，同時表面可及性大于1；再利用網絡服務器SOMPA對不同組合的串聯體二級結構進行分析，使表位形成β轉角和無規則卷曲結構；通過以上生物信息學方法對表位串聯體的分析，最終得到的串聯體組合為：T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4；再合成串聯體基因，并通過原核表達制備β-乳球蛋白表位串聯體重組蛋白；最后，以串聯體蛋白為抗原，通過常規方法獲得β-乳球蛋白IgE線性表位串聯體蛋白多克隆抗體；

（4）按步驟（2）對β-乳球蛋白IgE線性表位串聯體多克隆抗體進行純化；再把純化得到的β-乳球蛋白IgE線性表位串聯體多克隆抗體與長鏈生物素按1：20的摩爾比混合，冰浴2h，接著用脫鹽柱除去多余的生物素；

（5）在表位肽兩端各加入一個氨基酸作為阻斷肽，合成這7個表位肽及其阻斷肽，采用間接競爭ELISA法分析β-乳球蛋白IgE線性表位串聯體多克隆抗體對表位肽及阻斷肽的識別能力；將β-乳球蛋白標準品用碳酸鹽緩沖液稀釋后，100μL/孔加入板A，4°C包被過夜，PBST洗三次，每次3min扣干；另取一塊酶標板B，板A與板B中每孔加入250μL的3%明膠溶液37°C封阻；板B封阻1h后清洗，每孔加入β-乳球蛋白IgE線性表位串聯體多克隆抗體和濃度梯度的多肽各60μL，PBS為對照，37°C孵育1h；板A用PBST清洗3次，從板B中取100μL抗體與多肽的反應液加入到板A中，37°C孵育1h后清洗，每孔加入100μLOPD顯色液，37°C避光孵育15min后，每孔加入50μL2M的H₂SO₄終止反應，然后立即用酶標儀測吸光值；根據吸光值計算不同濃度肽的抑制率，根據抑制率高低可以反映串聯體多克隆抗體對不同表位肽和阻斷肽識別能力的強弱；

（6）以β-乳球蛋白多克隆抗體為捕獲抗體，生物素化β-乳球蛋白IgE線性表位串聯體多克隆抗體為檢測抗體，β-乳球蛋白為檢測抗原，采用棋盤法確定捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度；酶標板每孔加入100μL碳酸鹽稀釋的捕獲抗體，4°C包被過夜，PBST洗三次，每次3min扣干，每孔加入250μL的4%明膠溶液37°C封阻1.5h；清洗后，每孔加入100μL已知濃度梯度的β-乳球蛋白，37°C孵育1.5h；清洗后，每孔加入100μL檢測抗體，37°C孵育0.5h；清洗后，每孔加入100μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，37°C孵育1h；清洗后，每孔加入100μLOPD溶液，37°C避光孵育20min后，每孔加入50μL2M的H₂SO₄終止反應，然后用酶標儀測吸光值，根據吸光值和抗原濃度的關系繪制β-乳球蛋白標準曲線；

（7）液態乳制品：取一定量的液態乳制品于離心管中，用低溫離心機10,000g，4°C離心15min，去除脂肪層和沉淀，取樣用封阻液稀釋至檢測線性范圍內作為待檢樣品;粉狀乳制品：稱一定量的樣品用PBS稀釋，溶解后離心，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀釋至檢測線性范圍內作為待檢樣品；

（8）將所需檢測的食品進行預處理，制備檢測樣，根據上述方法包被捕獲抗體、封閉清洗后，每孔加入預處理的樣品，孵育清洗后，按步驟（6）依次加入檢測抗體、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素、OPD溶液，經H₂SO₄終止反應后，用酶標儀檢測吸光值，把吸光值帶入標準曲線計算出被檢樣品中β-乳球蛋白及其致敏性殘基的含量。