[發明專利]鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法

有效

• 申請號: 201610234530.1
• 申請日: 2016-04-15
• 公開（公告）號: CN105754932B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 楊明;李意捷;雷鵬輝;蔣麗輝;吳明紅
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 顧勇華

本發明公開了一種鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法，適用于生物工程技術領域，選鯉魚進行解剖，無菌取肝臟并剪碎，用胰蛋白酶消化后經細胞篩過濾得細胞懸液，后經Percolll純化，加入含有鯉魚血清的培養液得到新的細胞懸液；用血小球計數板進行計數，再以最適培養條件鋪板法培養增殖，最后對得到的原代肝細胞多種方法鏡檢鑒定。本發明鯉魚原代肝細胞的純化和培養方法直接無菌取鯉魚肝臟，經Percolll純化肝細胞，經鑒定，確實得到了數量多、純度高的離體鯉魚原代肝細胞，并用鯉魚血清代替傳統培養基中的配牛血清，提高了所提取離體細胞的活力，為進一步開展鯉魚原代肝細胞毒理試驗及其他實驗打下基礎。

技術領域

本發明涉及一種生物材料提取和培養方法，特別是涉及一種魚類局部組織細胞的提取和培養方法，應用于生物工程技術領域。

背景技術

肝臟作為魚體最大的解毒和代謝器官，在營養物質的消化吸收和保障魚體健康方面起著重要作用。由于其復雜性與重要性，對魚類肝臟的研究歷來是魚類生物學的重點內容，成果涉及魚類解剖學、組織學、免疫學、生理學、病理學、毒理學、營養學等許多領域。由于體內肝臟毒性實驗需要的動物樣本量大、花費高昂，且實驗結果的敏感性和重復性較差，開展體外細胞實驗是解決這問題的方向。細胞培養最大的優勢就是由于擺脫了實驗動物整體存在時的局限性，通過建立細胞培養模型，可以提高實驗的可操作性、重復性和結果的準確性。與傳代肝細胞株相比，原代肝細胞能較好地保留和維持活體肝細胞的完整形態和代謝活性，突變和變異性小，可真實反應體內代謝情況。所以，原代肝細胞的培養為深入研究魚類肝臟提供了一個有用的平臺。

鯉魚屬鯉科，Cyprinidae，是一種原產亞洲的淡水魚，在全國各地均有分布，是我國主要的養殖魚種之一。鯉魚具有很大的食用和觀賞價值，深受我國廣大消費者喜愛。所以作為我國水環境中典型魚種之一，鯉魚和人類聯系緊密，可以通過探索鯉魚自身受環境影響程度進而來評估環境對人類的影響。鑒于魚類肝臟在機體中的重要性，通過在體外模擬肝細胞的生長環境，研究有毒物質對其代謝功能的影響，能更直觀的體現出該有毒物質的代謝毒性，從而評價環境對魚體的影響。所以提取鯉魚原代肝細胞對進行環境毒理實驗具有十分重要的意義，但通過目前的方法提取的鯉魚原代肝細胞的純度和活性不夠理想。

發明內容

為了解決現有技術問題，本發明的目的在于克服已有技術存在的不足，提供一種鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法，采用無菌剪取鯉魚肝臟，胰蛋白酶消化后經篩網過濾，經密度梯度離心后加入特定培養基中，得到鯉魚原代肝細胞。本發明鯉魚原代肝細胞的純化和培養方法，能實現利用多種方法經行鏡檢鑒定，能夠很好的保證離體肝細胞的純度和活力，從而能夠保證滿足以鯉魚肝細胞為實驗對象的環境激素毒理實驗及其他實驗的需要，并為進一步開展更深層次的鯉魚肝細胞毒理實驗打下基礎。

為達到上述發明創造目的，采用下述技術方案：

一種鯉魚原代肝細胞的提取和培養方法，選擇規格均勻、體格健壯的平均體重400-600 g的鯉魚預養2周，然后，在無菌條件下進行如下過程：

a．無菌取鯉魚肝臟和鯉魚肝臟預處理：用魚用麻醉劑將魚麻醉5分鐘后，用無菌注射器從尾靜脈抽血至魚腮微白，用剪刀從肛門處沿腹中線向前剪至下頜，再沿鰓蓋后緣剪至下頜，打開左側體壁肌肉，找到鯉魚肝臟所在位置，用高壓滅菌的解剖器具無菌取肝臟，并將之置于D-Hank’s平衡鹽工作液中，用D-Hank’s平衡鹽工作液清洗肝臟組織2-3次至肝臟發白，以洗去肝臟組織中殘留的血液，完成鯉魚肝臟預處理過程；

b．機械破碎鯉魚肝臟和對鯉魚肝臟和消化處理：將在所述步驟a中選取和經過預處理的鯉魚肝臟剪碎成約1 mm × 1 mm 塊狀，再用D-Hank’s平衡鹽工作液清洗肝臟組織塊至少1次，然后加入塊狀鯉魚肝臟的10倍體積的0.25%胰酶，在在25℃條件下進行40 min消化處理，在消化期間不斷轉動肝臟組織，消化處理后吸出大塊肝臟組織，用移液槍溫和吹打用機械切割力幫助肝臟組織消化，當向加入與胰酶同體積的培養基時停止消化過程，得到肝臟組織消化液；