[發明專利]一種采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法

有效

• 申請號: 201610231687.9
• 申請日: 2016-04-14
• 公開（公告）號: CN105754949B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 宋應亮;朱文忠;劉向偉;周宇超;譚乃文;張思佳;許曉茹;任帥
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 王霞

1.一種采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將Sema3A的基因序列克隆到質粒上，獲取Sema3A重組質粒；

所述的Sema3A重組質粒，是通過DNA限制性內切酶的作用，將酶切后的Pwpi質粒和Sema3A基因片段連接后制得；

2)將Sema3A重組質粒轉化進入細菌，并對Sema3A重組質粒基因進行測序驗證；

3)將測序驗證過的含有Sema3A重組質粒的細菌進行擴增培養，然后提取擴增培養后細菌內含有的Sema3A重組質粒；

4)將Sema3A重組質粒和輔助包裝質粒共轉入293T細胞，獲取Sema3A慢病毒表達載體；

5)將獲取的Sema3A慢病毒表達載體感染脂肪干細胞，促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化。

2.根據權利要求1所述的采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，步驟1)中通過設計Sema3A基因的引物序列，以PCR的方法獲得大量的Sema3A基因序列；其中，Sema3A引物序列為：

上游引物序列5'TATGAGTGATGTAAGAAGGGTG 3'；

下游引物序列5'CTGGTCGTGGATAAGGGA 3'。

3.根據權利要求2所述的采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，PCR反應體系共計20μl，包括：

2×Taq PCR Master Mix 10μl；

濃度0.5μM/L的上下游引物混合物 0.5μl；

滅菌雙蒸水 8.5μl；

合成的cDNA 1μl。

4.根據權利要求2所述的采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，PCR反應程序設定為：

95℃300s；

95℃30s，60℃30s，72℃60s，循環40次；

72℃300s；

4℃冷卻。

5.根據權利要求1所述的采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，步驟2)將Sema3A重組質粒轉化進入細菌，是將Sema3A重組質粒轉入具有氨芐青霉素抗性的top10大腸桿菌中培養。

6.根據權利要求1所述的采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，步驟4)所述的輔助包裝質粒為PsPAX2和PMD2G。

7.根據權利要求6所述的采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，Sema3A重組質粒與輔助包裝質粒PsPAX2、PMD2G按6μg:3μg:1μg的用量混合后共轉入293T細胞。

8.根據權利要求1所述的采用Sema3A基因促進脂肪干細胞成骨分化、抑制成脂分化的方法，其特征在于，感染的脂肪干細胞為從離體組織中分離培養的脂肪干細胞。