[發明專利]人工合成的編碼胸苷磷酸化酶蛋白的基因及其應用

有效

• 申請號: 201610229357.6
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN107287221B
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 丁雪峰
• 申請（專利權）人: 南京諾云生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/63;C12N1/21;C12N9/10;C12R1/19
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 張慧清

本發明涉及人工合成的編碼胸苷磷酸化酶蛋白的基因及其應用，屬于生物工程領域。通過使用本發明的優化后的基因序列，來表達胸苷磷酸化酶突變體，能有效提高單位菌體的總酶活，可有效降低抗愛滋病藥物中間體β?胸苷的生產成本。只要一般的發酵車間（如氨基酸、維生素生產車間）即可進行投入生產，不需購置特殊設備，易于推廣應用。

技術領域

本發明涉及人工合成的編碼胸苷磷酸化酶蛋白的基因及其應用，屬于生物工程領域。

背景技術

胸苷是一種重要的醫藥原料中間體和生化試劑，在生物化工領域的研究和生產中有著十分廣泛的應用。胸苷是制備抗愛滋病藥——疊氮胸苷(AZT)的重要原料，但要求其含量必須在98％以上，而且其中的5-甲基尿苷的含量不能超過0.3％。目前胸苷的制備主要有化學合成和DNA酶解兩種方法：由化學合成法所得到的胸苷粗品中含有油狀物，色素，5-甲基尿苷等胸苷衍生物，并且存在光學異構體難以去除；工藝過程中亦需要使用大量有毒有害的有機溶劑，對環境污染亦存在危險。而酶解法通過水解RNA或DNA等天然物質，所得到的胸苷粗品中含有脫氧腺苷(dA)，脫氧胞苷(dC)，脫氧烏苷(dG)，脫氧肌苷(dI)等雜質，分離提取十分復雜。

胸苷磷酸化酶在生物合成核苷藥物中具有重要作用。合成出的核苷藥物被廣泛應用于醫藥領域，如治療艾滋病的HIV逆轉錄酶抑制劑齊夫多定(AZT)、雙脫氧肌苷(ddl)、扎西他濱(ddC)等。

胸苷磷酸化酶可特異性作用于β-胸苷，催化β-胸苷可逆磷酸化反應，由β-胸苷生成脫氧核糖-1-磷酸及胸腺嘧啶，亦可由脫氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶生成β-胸苷。

我們通過對序列表中序列2所示的大腸桿菌MG1655的胸苷磷酸化酶蛋白進行定向突變，獲得了序列表中序列4所示的突變的胸苷磷酸化酶蛋白，從而產生了本發明所要解決的問題，即如何使其在大腸桿菌內高效表達。

發明內容

我們通過全基因合成的方法，對基因的二級結構以及密碼子偏好性進行調整，以實現在大腸桿菌中的高表達。同時，在合成時引入以下位置的五個氨基酸突變：L10A，A209G，F210G，A221V，A413D，利用Primer Premier(http：//primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http：//genomes.urv.es/OPTIMIZER/)進行設計，并保證Tm差異控制在3℃以內，引物長度控制在50base以內，得到以下引物：

合成上述引物，并將獲得的引物加雙蒸水溶解后，加到如下的反應體系中，使得各引物的終濃度為30nM，首尾引物的終濃度為0.6μM。