[發(fā)明專利]一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610228960.2
• 申請(qǐng)日: 2016-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN105794650B
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳利萍;曹麗雯;于寧寧;李俊星;葉立新;劉勝龍;彭輝;劉玲娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00;A01G31/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）采集廣西越桔植株上表面呈現(xiàn)綠色、表皮堅(jiān)硬的未成熟果實(shí)，消毒后，用解剖刀切開未成熟果實(shí)，剝?nèi)∥闯墒旆N子連同部分子房組織，接種到培育培養(yǎng)基上；于25°C黑暗條件下培養(yǎng)24 h，再在光照強(qiáng)度為20 μmol·m^-2·s^-1、光照時(shí)間為12小時(shí)/天的弱光照條件下培養(yǎng)，直到種子成熟；其中，培育培養(yǎng)基以WPM（Woody Plant Medium）為基本培養(yǎng)基，另外添加蔗糖、瓊脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白，蔗糖、瓊脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白的濃度分別為0.03 g/mL、0.012 g/mL、0.002g/mL、0.0004 g/mL、0.0005 g/mL，pH為5.0；

（2）種子發(fā)育成熟后，將種子轉(zhuǎn)移至萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)萌發(fā)，培養(yǎng)條件：溫度為25°C、光照強(qiáng)度為20 μmol·m^-2·s^-1、光照時(shí)間為12小時(shí)/天；

（3）種子萌發(fā)后，將幼苗轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，并且可以通過擴(kuò)繁培養(yǎng)基誘導(dǎo)其腋芽生長，進(jìn)行大量擴(kuò)繁；壯苗后將植株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度為25°C、光照強(qiáng)度為50 μmol·m^-2·s^-1、光照時(shí)間為12小時(shí)/天；

（4）待植株生根后，將其煉苗后轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土中栽培，栽培條件：溫度為22°C、光照強(qiáng)度為50 μmol·m^-2·s^-1、光照時(shí)間為12小時(shí)/天。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步驟（1）中，所述消毒程序?yàn)椋孩僭?L水中加入5ml洗潔精，得到洗潔精水；將未成熟果實(shí)在洗潔精水中浸泡清洗20分鐘；②用自來水沖洗浸泡過的果實(shí)2個(gè)小時(shí)；③在超凈工作臺(tái)上，將沖洗后的未成熟果實(shí)在體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇水溶液中浸泡30秒，浸泡后用無菌水沖洗果實(shí)3次，每次1分鐘；④用質(zhì)量體積比為0.1%的升汞水溶液浸泡消毒10分鐘，期間搖動(dòng)3-5次，消毒結(jié)束后用無菌水沖洗5次，每次1分鐘；⑤將沖洗后的果實(shí)置于無菌濾紙上，將果實(shí)表皮上多余的水分吸干。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步驟（1）中，所述未成熟種子剝?nèi)》椒橛脺缇馄实肚谐麑?shí)上下兩端各0.3cm，然后縱向切開，左手持鑷子夾住果實(shí)外皮，右手持解剖刀將未成熟種子及部分子房組織取下。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步驟（1）中，所述未成熟種子的種皮表面呈淺黃褐色，所述成熟種子的種皮表面呈現(xiàn)深棕褐色。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步驟（2）中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基由WPM、蔗糖、瓊脂、6-芐氨基腺嘌呤和赤霉素組成，蔗糖、瓊脂、6-芐氨基腺嘌呤、赤霉素的濃度分別為0.03 g/mL、0.012 g/mL、1×10^-6g/mL、1.5×10^-6 g/mL，pH為5.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步驟（3）中，所述生長培養(yǎng)基由WPM、蔗糖、瓊脂組成，蔗糖、瓊脂的濃度分別為0.03 g/mL、0.012 g/mL，pH為5.0。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步驟（3）中，所述擴(kuò)繁培養(yǎng)基由WPM、蔗糖、瓊脂、6-芐氨基腺嘌呤組成，蔗糖、瓊脂、6-芐氨基腺嘌呤的濃度分別為0.03 g/mL、0.012 g/mL、2×10^-6 g/mL，pH為5.0。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步驟（3）中，所述生根培養(yǎng)基由WPM、蔗糖、瓊脂、吲哚丁酸組成，蔗糖、瓊脂、吲哚丁酸的濃度分別為0.03 g/mL、0.012 g/mL、1×10^-6 g/mL，pH為5.0。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過未成熟種子保存極小種群廣西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步驟（4）中，所述營養(yǎng)土由草炭和蛭石組成，草炭和蛭石的質(zhì)量比為3：1。