[發明專利]利用副產物二氧化碳自控pH的全細胞催化生產戊二胺的方法

在審

• 申請號: 201610227775.1
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN107338275A
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發明（設計）人: 溫廷益;劉樹文;馬吉銀;李戴歡;梁勇;商秀玲;張蕓;鄧愛華;郭小煒;趙春光
• 申請（專利權）人: 寧夏伊品生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京律和信知識產權代理事務所(普通合伙)11446
• 代理人: 鮑曉芳,劉國偉

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及利用副產物二氧化碳自控pH的全細胞催化生產1,5-戊二胺的方法。

背景技術

1,5-戊二胺(1,5-Pentanediamine)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷(1,5-Diaminopentane)，與二元酸可聚合成高分子聚酰胺材料(即尼龍)。全球每年生產約700萬噸聚酰胺材料，消耗大量石化資源，因此生物法合成聚酰胺的重要組成單體—1,5-戊二胺具有重要的經濟學和生態學意義。

全細胞催化法以賴氨酸為底物，利用菌體細胞中的賴氨酸脫羧酶催化產生1,5-戊二胺。目前，賴氨酸作為大宗氨基酸品種之一，其產能嚴重過剩，利潤率極低。因此，開發高效的以賴氨酸為底物的1,5-戊二胺生物催化的生產方法，不但可以開發新型生物基材料市場，還可以推進氨基酸發酵產業的轉型升級。

在全細胞催化生產1,5-戊二胺的現有技術中，通常在宿主菌中過表達源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶基因cadA，構建得到能夠催化生產1,5-戊二胺的菌體細胞。酶學活性測定發現cadA基因編碼的賴氨酸脫羧酶的最適催化pH為5.5，當pH大于5.5時，賴氨酸脫羧酶的活性隨著pH升高而降低(Biochemistry,1974,13:662-670；Microbiology,1998,144:751-760；The EMBO Journal,2011,30:931–944)。然而，在賴氨酸全細胞催化生成1,5-戊二胺的過程中，催化液pH持續上升，理論上會導致賴氨酸脫羧酶活性降低，從而降低催化合成1,5-戊二胺的效率。為了控制全細胞催化體系的pH維持在較低水平，通常使用高濃度緩沖液，或著在催化過程中實時補加酸性pH調節劑。酸性pH調節劑通常為無機酸(如鹽酸和硫酸)或有機酸(如丁二酸、己二酸和癸二酸等)，如此在催化液中形成相應的戊二胺鹽，如戊二胺鹽酸鹽、戊二胺硫酸鹽、戊二胺丁二酸鹽、戊二胺己二酸鹽等。

在全細胞催化生產1,5-戊二胺的現有技術中，日本味之素公司率先開 發了使用過表達賴氨酸脫羧酶基因的大腸桿菌全細胞催化生產戊二胺的方法(美國專利US7189543、歐洲專利EP1482055)。該方法在50L發酵罐中，使用己二酸、丁二酸或癸二酸調節催化體系的pH維持在6.0或6.5，全細胞催化生產戊二胺。類似的，日本三井化學株式會社使用鹽酸調節催化反應液的pH維持在6.0(國際專利PCT/JP2011/054388，中國專利CN102782146)，或使用己二酸調節催化反應液的pH維持在6.5(國際專利PCT/JP2008/050265，中國專利CN10158256)，使全細胞催化生產戊二胺的反應順利進行。國內技術使用6mol/L的HCl在線調節戊二胺催化反應液的pH維持在5.5，催化32小時可得到60.54g/L戊二胺(中國專利CN103725724)。PCT/CN2015/082400專利技術則在催化過程中流加硫酸或磷酸調節戊二胺催化液的pH維持在6.5。

此外，賴氨酸通過賴氨酸脫羧酶催化生成1,5-戊二胺，并同時產生二氧化碳。在全細胞催化生產1,5-戊二胺的過程中，通入空氣有利于二氧化碳排出全細胞催化體系，降低反應液中二氧化碳的濃度，從而減少產物競爭性抑制，有利于催化反應向1,5-戊二胺生成的酶促方向進行。例如，在調控1,5-戊二胺催化液pH的現有技術中，美國專利US7189543和歐洲專利EP1482055以0.1vvm的速率通入空氣，中國專利CN10158256則以0.5vvm的速率通入空氣，國際專利PCT/CN2015/082400技術以1vvm通氣量通入空氣。

雖然pH調控和曝氣過程在理論上有利于酶促反應向1,5-戊二胺生成的方向進行，但是在實際生產應用中，這兩項過程控制步驟將會限制1,5-戊二胺全細胞催化在工業化生產中的應用：pH調控過程消耗大量的酸，將會增加輔料成本；鹽酸和硫酸等無機酸腐蝕性強，對設備材質要求高，將會增加設備投資；己二酸和癸二酸等有機酸難溶于水，需要以干粉或配制成漿狀膏狀物的形式補料，將會增加補料管道的設計難度；曝氣過程導致pH上升速率快，將會增加pH調節劑的用量；曝氣過程導致部分1,5-戊二胺氧化，將會降低產物純度；曝氣過程的氣提作用，使排放的尾氣中含有二氧化碳和戊二胺，將會導致空氣污染、增加企業的環境治理費用。

發明內容