[發(fā)明專利]一種利用膜層析技術(shù)純化α1-抗胰蛋白酶的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610227427.4
• 申請(qǐng)日: 2016-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN105753973A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋偉杰;萬(wàn)印華;羅建泉;樊金鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所
• 主分類號(hào): C07K14/81
• 分類號(hào): C07K14/81;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;侯瀟瀟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物材料分離純化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用膜層析技術(shù)純化α1-抗胰蛋白酶的方法。

背景技術(shù)

α1-抗胰蛋白酶(α1-antitripsin，AAT)是血漿中主要的蛋白酶抑制劑，占血漿總蛋白酶抑制能力的90％以上。它能抑制多種絲氨酸內(nèi)切肽酶，如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)、胰蛋白酶、血漿素、凝血酶等，其主要作用是保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞和器官不受蛋白酶的損傷，抑制感染和炎癥，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡。血漿中的α1-AAT主要由肝臟產(chǎn)生，其它如腸、腎、脾等也能產(chǎn)生少量的α1-AAT，這些肝外合成的α1-AT在局部組織損傷的調(diào)節(jié)中起重要作用。

AAT的制備主要是從血漿沉淀CohnIV出發(fā)，加入大量緩沖液以充分溶解蛋白，并降低其中的乙醇濃度以穩(wěn)定目標(biāo)蛋白，最后經(jīng)PEG沉淀除去脂蛋白，所得蛋白料液中AAT濃度約為0.1mg/mL，含有一定量的雜蛋白，需要進(jìn)一步的純化。CN1900107A采用陰離子交換柱層析的方法進(jìn)行純化，CN102993298A采用陰離子交換層析和陽(yáng)離子交換層析兩步柱層析的方法進(jìn)行純化，CN102180966A采用兩步陰離子交換柱層析方法進(jìn)行純化，CN101747432A和CN101275956A采用陰離子交換柱層析和分子篩層析兩步層析的方法進(jìn)行純化。可見在α1-抗胰蛋白酶的純化過程中，層析是一種主要的純化手段，但是目前的層析過程均采用的是柱層析，存在著流速低，壓降大，擴(kuò)散傳質(zhì)阻力大，緩沖液消耗量大，蛋白容易失活等缺點(diǎn)。

因此，在本領(lǐng)域亟需一種更加高效的純化α1-抗胰蛋白酶的方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用膜層析技術(shù)純化α1-抗胰蛋白酶的方法，該方法減少了聚集體，降低乙醇對(duì)目標(biāo)蛋白活性的影響，并且縮短了單元操作時(shí)間，減少了緩沖液用量，是一種高效經(jīng)濟(jì)的蛋白純化手段。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種α1-抗胰蛋白酶的純化方法，所述純化方法包括以下步驟：

(1)將Cohn法組份Ⅳ沉淀溶解；

(2)向步驟(1)所得溶解液中加入PEG進(jìn)行沉淀，取上清液；

(3)將步驟(2)得到的上清液進(jìn)行微濾；

(4)將步驟(3)所得濾液經(jīng)過陰離子交換膜層析吸附α1-抗胰蛋白酶，而后利用洗脫液進(jìn)行洗脫，收集含有α1-抗胰蛋白酶的洗脫液；

(5)利用疏水層析膜色譜對(duì)步驟(4)所得含有α1-抗胰蛋白酶的洗脫液進(jìn)行進(jìn)一步純化；

(6)對(duì)步驟(5)所得流穿液進(jìn)行超濾、除菌、凍干得到所述α1-抗胰蛋白酶。

在α1-抗胰蛋白酶的純化過程中，為減少聚集體和降低乙醇對(duì)目標(biāo)蛋白活性的影響，從體積較大的蛋白料液中快速捕獲并分離α1-抗胰蛋白酶對(duì)保持其穩(wěn)定性尤為關(guān)鍵。現(xiàn)有技術(shù)中柱層析是蛋白分離純化的主流工藝，其以擴(kuò)散為主的傳質(zhì)方式并不適用于處理本料液體系，特別是高流速帶來(lái)的高反壓不利于整個(gè)純化流程。而本發(fā)明利用的膜色譜技術(shù)融合了柱層析高選擇性和膜過濾高通量的特點(diǎn)，以對(duì)流為主的傳質(zhì)方式使得膜色譜可以直接、快速捕獲微量目標(biāo)蛋白，能較好地滿足當(dāng)前的純化需求。并且本發(fā)明結(jié)合使用陰離子交換膜層析與疏水層析膜色譜，可以提高對(duì)α1-抗胰蛋白酶的純化效率，提高其純度，并且可以保障α1-抗胰蛋白酶的活性，獲得高活性α1-抗胰蛋白酶。

在本發(fā)明所述純化方法中，步驟(1)使用緩沖液將Cohn法組份Ⅳ沉淀溶解。

優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸緩沖液、Tris緩沖液或醋酸緩沖液中的任意一種，優(yōu)選為磷酸緩沖液。

優(yōu)選地，所述緩沖液的pH值為6.5-8.5，例如6.5、6.7、6.9、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4或8.5，優(yōu)選7.0。

優(yōu)選地，使用緩沖液將Cohn法組份Ⅳ沉淀溶解后，在0-10℃(0℃、2℃、4℃、6℃、8℃或10℃)下攪拌1-8小時(shí)(例如1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)或8小時(shí))，而后離心去除沉淀，得到溶解液。

優(yōu)選地，所述離心轉(zhuǎn)速為3000-8000轉(zhuǎn)/分鐘，例如3000轉(zhuǎn)/分鐘、3500轉(zhuǎn)/分鐘、4000轉(zhuǎn)/分鐘、4500轉(zhuǎn)/分鐘、5000轉(zhuǎn)/分鐘、5500轉(zhuǎn)/分鐘、6000轉(zhuǎn)/分鐘、6500轉(zhuǎn)/分鐘、7000轉(zhuǎn)/分鐘、7500轉(zhuǎn)/分鐘或8000轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選5000轉(zhuǎn)/分鐘。

優(yōu)選地，所述離心時(shí)間為20-60分鐘，例如20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘或60分鐘，優(yōu)選30分鐘。