[發明專利]菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制劑Bdellin-HM及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201610226789.1
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105646702B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 賴仞;龍承波;賴艷梅;李博文
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C12N15/15
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

一種菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制劑Bdellin?HM及其編碼基因和應用，該菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制劑Bdellin?HM,分子量17432.8道爾頓，等電點4.84，全序列如SEQ ID NO:2所示，其第4位與第29位，第6位與第25位，第14位與第40位的半胱氨酸形成3對分子內二硫鍵。如SEQ ID NO:1所示編碼的基因由504個核苷酸組成，其中編碼成熟肽部分的為第55?501為核苷酸。有益效果在于:分離純化得到菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制劑Bdellin?HM,并克隆得到其cDNA序列；該抑制劑表現出顯著的胰蛋白酶抑制活性（K_i~8.45nM），但未觀察到彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽釋放酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、FXIIa、FXIa和FXa的抑制作用，能作為制備胰蛋白酶抑制劑的應用。

技術領域：

本發明提供一種菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)Kazal型胰蛋白酶抑制劑Bdellin-HM及其編碼基因和應用，屬于生物醫學技術領域。

背景技術：

蛭類是我國的一種傳統中藥，對于水蛭抗凝血作用的記載是公元前2世紀的“爾雅”、明朝李時珍的《本草綱目》和《神農本草經》?！侗静菥V目》謂其：“咸走血，苦勝血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝經血分藥，故能通肝經聚血?！敝嗅t認為水蛭是一種傳統的破血藥，有逐瘀、通經脈、利水道的功效，主要用于治療血瘀經閉、中風偏癱、跌打損傷等疾病。蛭類療法有很長的歷史，在公元前1500年的埃及法老陵墓中就有使用蛭類治療的圖畫。2005年，歐洲正式批準蛭類療法為合法的治療手段。每年僅在德國就有35萬條水蛭用于醫療。

菲牛蛭(Hirudinaria manillensis)，別名馬尼擬醫蛭，俗稱金邊螞蟥。蛭綱,醫蛭科牛蛭屬，是目前常見吸血蛭類中個體較大的品種。該物種的模式產地在菲律賓呂宋島。分布于印度尼西亞、菲律賓、印度、孟加拉、斯里蘭卡、緬甸、泰國、越南、臺灣島以及中國大陸的福建、廣東、廣西、海南等地。主要棲息于弱酸性(pH值5.5～7.0)的水田、水溝或池塘里。當人畜經過時，就附著吸食血液。菲牛蛭能分泌抗凝血的物質，破壞凝血功能，因此被菲牛蛭咬過的傷口常流血不止。民間也利用這一性質，用菲牛蛭來治療病人的局部血流不暢，但是人們對這些治療作用的物質基礎和分子機制還了解很少。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor)廣泛分布于動植物和微生物中，現有超過500個家族成員被發現。通過調節絲氨酸蛋白酶的活性，絲氨酸蛋白酶抑制劑參與調節體內許多重要的生命活動過程，具有抗凝、抗炎、抗感染、抗腫瘤等生理活性，現已廣泛應用于急性胰腺炎、外科手術、腫瘤、腦血管疾病等疾病治療。此外，在凝血系統和補體系統中發揮作用的蛋白酶也會受絲氨酸蛋白酶抑制劑的調控以避免其蛋白酶活性對周圍組織造成破壞。Kunitz,Kazal,Bowman-Birk,a-2-macroglobulin和serpin是研究較為廣泛的絲氨酸蛋白酶抑制劑類型。

來自歐洲醫蛭的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑LDTI是第一個人類肥大細胞類胰蛋白酶緊密結合的蛋白酶抑制劑，可能作為一個藥理探針來評估肥大細胞類胰蛋白酶在哮喘、關節炎、牙周疾病、皮膚疾病和血液凝固障礙中的病理生理作用。另外從歐洲醫蛭中發現的Bdellin B-3和日本醫蛭中發現的Bdellin-KL都表現出對胰蛋白酶、血纖維蛋白溶酶和精子頭粒蛋白的抑制作用，暗示它們可能在生物繁殖過程中起作用。

目前，國內外尚未見菲牛蛭Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑的有關研究報道

發明人將本發明的菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制劑Bdellin-HM全序列氨基酸結構經蛋白質數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同多肽。發明人將本發明的菲牛蛭Kazal型胰蛋白酶抑制劑Bdellin-HM編碼基因經基因數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同基因。

發明內容：