[發(fā)明專利]一種唾液中巴豆醛?DNA加合物的測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610226543.4
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105929034B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳歡;侯宏衛(wèi);胡清源;劉魯娟;張小濤;付亞寧;韓書磊
• 申請（專利權(quán)）人: 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

1.一種唾液中巴豆醛-DNA加合物的測定方法，所述巴豆醛-DNA加合物是1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG），其特征在于：包括以下具體步驟：

a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器對人體唾液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化采集；

b、唾液DNA的提?。篛ragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 凈化液，渦旋振蕩，冰浴孵育10 min；于室溫下離心；移取上層清液于一新的微量離心管中，加入純乙醇，輕輕震蕩數(shù)秒；靜置使DNA分子完全沉淀，離心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA團(tuán)塊；用超純水復(fù)溶DNA；用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA一個吸收單位（OD）相當(dāng)于50 μg/mL；

c、DNA的酶水解及純化富集：將上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂緩沖液中；加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液和30U脫氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U堿性磷酸酶在37℃中繼續(xù)孵育2h，水解液經(jīng)Strata-X固相萃取，收集洗脫液液氮吹至干，復(fù)溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即為樣品待測液；

d、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的1,N²-丙醇-鳥嘌呤（Propano-dG）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

e、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進(jìn)行測定，測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量，在LC-MS/MS測定中，選取Thermo Acdiv^TM Polar Advantage II C18 色譜柱，規(guī)格4.6×150 mm，3 μm，流動相體系選取A：0.01%甲酸甲醇，B：10 mM乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序：0-2 min：25% A，2-17 min：35% A，17-25 min：25% A；流速為0.38 mL/min；分析時間為25 min，進(jìn)樣量為5 μL；

串聯(lián)質(zhì)譜檢測器的條件：電噴霧離子源ESI，多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V，離子源溫度：550℃，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為70 psi，干燥氣為75 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V, 碰撞能：9 eV，駐留時間：100 ms；監(jiān)測離子對為Propano-dG：338.3→222.1定量離子對，338.3→117.2定性離子對；內(nèi)標(biāo)[¹⁵N₅]Propano-dG為343.2→227.2。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液中巴豆醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟c中所述的內(nèi)標(biāo)溶液為10 ng/mL的 [¹⁵N₅]Propano-dG。