[發明專利]一種唾液中6種醛類-DNA加合物的測定方法

在審

• 申請號: 201610226337.3
• 申請日: 2016-04-13
• 公開（公告）號: CN105628848A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 侯宏衛;胡清源;陳歡;劉魯娟;陳建;張小濤;張森
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明屬于唾液樣本的理化檢驗技術領域，主要涉及唾液中N⁶-羥甲基-腺嘌呤 （HOMe-dA）、N²-羥甲基-鳥嘌呤（HOMe-dG）、N²-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG）、1,N²-丙醇- 鳥嘌呤（CdG）、6-羥基-1,N²-丙醇-2'-鳥嘌呤（α-Acr-dG）和8-羥基-1,N²-丙醇-2'-鳥嘌呤 （γ-Acr-dG）DNA加合物的測定技術領域，具體說是一種采用液相色譜-串聯質譜儀（LC-MS/ MS）測定唾液中6種醛類-DNA加合物的方法。

背景技術

甲醛、乙醛、丙烯醛和巴豆醛是一類廣泛存在于環境基質中的污染物。它們主要產 生于有機物的不完全燃燒，如工業生產、卷煙煙氣、機動車尾氣和烹飪油煙等。活潑的醛基 不需要經過機體代謝就能夠直接攻擊生物體內親核基團，如核酸中的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧 啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。上述醛類形成的主要DNA加合物包括N⁶-羥甲基-腺嘌呤 （HOMe-dA），N²-甲基-鳥嘌呤（HOMe-dG），N²-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG），1,N²-丙醇-鳥 嘌呤（CdG），α-Acr-dG和γ-Acr-dG，其中HOMe-dA、HOMe-dG和ethylidene-dG在單核苷酸狀 態下不穩定，需要將其在DNA酶水解階段還原為N⁶-甲基-腺嘌呤（Me-dA）、N²-甲基-鳥嘌呤 （Me-dG）和N²-乙基-鳥嘌呤（Et-dG）才能被檢出。

唾液是一種非侵入式的樣本采集方式，對受試者不造成影響樣本易獲得，是現成 可用的DNA來源。口腔是煙氣等有害成分直接暴露的靶器官，相關研究表明唾液中DNA的損 傷與口腔癌相關。唾液中較豐富的細胞類型為口腔上皮細胞與白細胞，因其生命周期較短， 唾液中DNA加合物的含量更加能顯示致癌物的近期暴露情況，唾液在檢測卷煙和食品致癌 物產生的DNA加合物方面具有很大的應用前景。

目前，關于DNA加合物的分析檢測方法報道的較多，主要有³²P-后標記技術、酶聯免 疫技術（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC-UV）和液相色譜-串聯質譜技術（LC-MS/MS）。其中 LC-MS/MS由于其較高的靈敏度和選擇性被廣泛應用于DNA加合物的檢測分析。目前，在唾液 中HOMe-dA、HOMe-dG、Ethylidene-dG、CdG、α-Acr-dG和γ-Acr-dG的高通量分析方法尚未見 報道。

發明內容

本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS） 技術建立的唾液中6種醛類-DNA加合物（HOMe-dA、HOMe-dG、Ethylidene-dG、CdG、α-Acr-dG 和γ-Acr-dG）的測定方法。該方法具有快速、準確、靈敏度高等特點，可用于唾液中6種醛 類-DNA加合物的同時定性定量分析。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種唾液中6種醛類-DNA加合物的測定方法，即HOMe-dA、HOMe-dG、Ethylidene-dG、 CdG、α-Acr-dG和γ-Acr-dG的測定方法，包括以下具體步驟：

a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）對人體唾液進行標準化采集。

b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 凈化液，渦旋振蕩，冰浴孵育10min；于室溫下離心；移取上層清液于一新的微量離心管中， 加入純乙醇，輕輕震蕩數秒；靜置使DNA分子完全沉淀，離心并去上清液；加入70%的乙醇水 溶液清洗DNA團塊。用超純水復溶DNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計在260nm處檢測 DNA的含量，對于雙鏈DNA一個吸收單位（OD）相當于50μg/mL。