[發(fā)明專利]牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610225968.3
• 申請日: 2016-04-12
• 公開（公告）號: CN105753947A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韋海濤;宋彥軍;馮小宇;楊春江;趙榮茂;王林;馬孝斌;梅力;于在江;雷琪莉;莫勛;李剛;高云玲
• 申請（專利權(quán)）人: 北京納百景弈生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/06
• 分類號: C07K14/06;G01N33/569;G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到一種牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

牛傳染性鼻氣管炎（infectiousbovinerhinotracheitis，IBR）是由牛皰疹病毒1型（BHV-1）引起的牛的一種急性接觸性傳染病。臨床上分呼吸道、生殖道、腦、結(jié)膜等多種感染類型，危害犢牛、母牛和公牛，該病死亡率較低，多呈亞臨床經(jīng)過，但易繼發(fā)細菌感染，導(dǎo)致支氣管肺炎等嚴重呼吸道疾病，對牛群有較大危害。根據(jù)王志亮等（2011）對來自北京、天津、陜西、山西、山東、新疆、河南、河北等地l1個奶牛場的996份血清樣品進行IBRV抗體檢測，共檢出陽性血清120份，檢出的群陽性率為77.8%，最高陽性率達55.0%，最低陽性率為0%，平均陽性率為12.1%，即測試牛場中大部分都不同程度的存在IBRV感染。由此可見IBRV發(fā)病率高，在我國分布極廣。

IBRV基因組為線性雙股DNA，整個基因組編碼33個結(jié)構(gòu)蛋白和15個非結(jié)構(gòu)蛋白，其中四個糖蛋白gB、gC、gD和gE是IBRV的主要抗原，而gD蛋白被認為是病毒粒子表面和病毒感染細胞的主要分子，是IBRV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是IBRV復(fù)制的必需基因，刺激機體產(chǎn)生中和抗體的主要糖蛋白，它不但誘導(dǎo)體液免疫，而且誘導(dǎo)細胞免疫，是目前IBRV特異性診斷的主要抗原。

常規(guī)的IBRV的診斷檢測主要有于經(jīng)典的病毒分離培養(yǎng)、免疫熒光、ELISA和分子生物學(xué)檢測手段如PCR等，這些均需依賴儀器設(shè)備及專業(yè)實驗人員的精細操作，要么成本高昂，要么耗時耗力，無法在基層牧場開展。

發(fā)明內(nèi)容

本申請的目的在于提供一種牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白。

本發(fā)明還要解決技術(shù)問題為提供上述牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白的應(yīng)用

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白，其特征在于，所述牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白的核酸序列為SEQIDNo.1所列的序列，其氨基酸序列為SEQIDNo.2所列的序列。

本發(fā)明的另外一個目的在于提供一種牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白的應(yīng)用。

一種所述的牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白在制備牛傳染性鼻氣管炎中檢測物的應(yīng)用。

進一步，本發(fā)明的目的還在于提供所述的牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白制備牛傳染性鼻氣管炎試劑盒中的應(yīng)用。

此外，本發(fā)明還提供了一種檢測牛傳染性鼻氣管炎的試紙條，包括PVC背板、樣品墊、金標墊、纖維素膜、吸水墊，其特征在于：所述金標墊上包被有膠體金標記的上述技術(shù)方案中的牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白；所述纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線分別包被有牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白和兔抗牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白抗體。

此外，本發(fā)明還提供了一種利用牛傳染性鼻氣管炎的膠體金試紙條檢測方法，方法操作簡易，適合于基層應(yīng)用。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取了以下的技術(shù)措施：

（1）通過昆蟲細胞桿狀病毒系統(tǒng)重組表達的方式獲得牛傳染性鼻氣管炎病毒gD蛋白并純化：參照GenBank中登記的IBRV基因序列設(shè)計引物，并引入EcoRⅠ和HindIII酶切位點。gD基因片段以pUC-gD質(zhì)粒為模板，用PCR方法擴增。純化的PCR產(chǎn)物與表達載體pFastBacHT-B雙酶切后，用T4DNA連接酶4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，制備陽性重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)座DH10Bac感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆后，提取Bacmid，轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細胞，觀察轉(zhuǎn)染后的細胞病變并收集重組桿狀病毒，鑒定后純化備用。

（2）重組gD蛋白的純化：將重組桿狀病毒以MOI0.1感染SF9昆蟲細胞，4d后5000r/min離心10min收集上清。目的蛋白的純化參照Ni-NTA純化系統(tǒng)說明書進行，純化后的蛋白用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量后分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）重組gD蛋白的標記：采用檸檬酸還原法制備膠體金，用常規(guī)手段將其與純化的gD蛋白標記。

（4）膠體金試紙條的制備及組裝；

（5）利用膠體金試紙條檢測牛血清樣本中的傳染性鼻氣管炎病毒抗體。

本發(fā)明的有益效果為：該試紙條以雙抗原夾心法為原理，檢測牛血清樣本中的傳染性鼻氣管炎病毒抗體，具有靈敏度高，特異性好，檢測快速方便，容易使用且無需特殊儀器設(shè)備的特點，可以在10min檢出結(jié)果，非常方便在基層養(yǎng)殖單位中推廣使用。

附圖說明

圖1：重組gD蛋白表達鑒定圖

圖2：膠體金試紙條組裝圖