[發明專利]轉CHI基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

有效

• 申請號: 201610221764.2
• 申請日: 2016-04-11
• 公開（公告）號: CN105713921B
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 趙靜雅;王路堯;張穎;付雪晴;張婷婷;張利達;錢虹妹;唐克軒
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N9/90;C12N15/61;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/14
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明是一種生物技術領域的轉CHI基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發明從青蒿中克隆查爾酮異構酶CHI基因，構建含CHI基因的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將CHI基因轉入青蒿并再生出植株，PCR檢測外源目的基因CHI的整合情況，高效液相色譜法及蒸發光散射檢測器測定(HPLC?ELSD)轉基因青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。本發明獲得的轉基因青蒿中青蒿素含量有所提升，最高達到非轉化對照植株的1.5倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用轉基因青蒿大規模生產青蒿素打下了基礎。

技術領域

本發明涉及一種生物技術領域的提高青蒿素含量的方法，特別是一種轉CHI基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技術

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有過氧橋的倍半萜內酯氧化物——青蒿素，是目前應用最廣泛，療效最好的抗瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，青蒿素聯合療法(ACTs)是世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法。隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗腫瘤、抗癌以及免疫調節的功能。

然而青蒿素在植物青蒿中的含量非常低，大規模商業化生產受到了限制，無法完全滿足全球的市場需求。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大，產量低，成本高，不具可行性。通過酵母工程生產青蒿素，前期投入成本大，且產量有限不能滿足需求。現有技術表明植物基因工程為提高青蒿中青蒿素的含量提供了一個可行的方法。

青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿葉片的正面和背面、莖稈、花上都大量存在分泌型腺毛，這里是大量次生代謝物的累積場所，青蒿素也被認為儲存于此處。

經過對現有技術文獻檢索發現，Jin-Ho Kang等在《Plant Physiology》(植物生理學)2014年164卷1161-1174頁發表了題為“The Flavonoid Biosynthetic EnzymeChalconeIsomerase Modulates Terpenoid Production in Glandular Trichomes ofTomato”(“查爾酮異構酶對番茄腺毛萜類物質生物合成的調控”)的論文，報道揭露了番茄CHI1基因和萜類合成有聯系，黃酮類和萜類路徑的代謝協調有助于優化毛狀體腺在動態環境中的作用。查爾酮異構酶(ChalconeIsomerase，CHI)是黃酮合成途徑中的一個關鍵酶，因此，克隆CHI基因并轉化青蒿，對探究黃酮類途徑和青蒿素途徑的代謝協調及基因工程育種具有重要意義。

本發明致力于采用基因工程手段，獲得青蒿素高產的青蒿植株，為規模化生產青蒿素提供一條新途徑。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種轉CHI基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發明涉及的基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、青蒿素提取及含量測定用于本發明，建立了穩定提高青蒿中青蒿素含量的方法，為利用青蒿大規模生產青蒿素奠定了基礎。

本發明提供一種轉CHI基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步驟：

(1)采用基因克隆方法獲得CHI基因；

(2)把所述CHI基因連接于表達調控序列，構建含CHI基因的植物表達載體；

(3)將所述含CHI基因的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得含所述CHI基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株；

(4)利用所述含CHI基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經PCR檢測的整合外源目的基因CHI的轉基因青蒿植株。

進一步地，所述CHI基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。