[發明專利]用于微囊化大腸桿菌口服疫苗免疫抗體檢測的檢測方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610220735.4
• 申請日: 2016-04-11
• 公開（公告）號: CN105759036A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 姚剛;徐新龍;夏瑞陽;馬雪連;王金泉;鐘旗;蘇艷;雷程紅
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 烏魯木齊博亞思知識產權代理事務所(普通合伙) 65110
• 代理人: 王志剛

技術領域

本發明屬于生物疫苗效果的檢測方法及檢測試劑盒的研發技術領域，特別是涉及一種用于微囊化口服疫苗免疫效果血清學抗體效價檢測的檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術

羊大腸桿菌病是由不同血清型的致病性大腸桿菌所引起幼畜腹瀉，尤其以新生幼畜特別易感，并可導致生長發育遲緩，生產性能低下，嚴重的甚至造成死亡，給畜牧業經濟的發展帶來嚴重影響。目前，本病的防治主要以藥物治療和疫苗接種為主，疫苗的接種通過刺激機體產生抗體，在畜牧業中可以對被接種的家畜提供經濟有效的免疫保護，同時能夠防止相對應的傳染病流行傳染或是大規模爆發。疫苗接種使用較多的接種途徑是注射接種和經口接種，在羊源致病性大腸桿菌病的防治中主要以注射接種疫苗為主，但注射接種時的針刺和針頭消毒不當都會給家畜造成一定程度的危害，并且在規模化養殖場中，免疫接種的次數較多，難免造成接種人員工作強度大，注射器針頭誤傷接種人員等情況出現。而口服接種途徑可以很好的解決上述在免疫接種過程中所遇到的弊端。口服疫苗的給藥途徑是通過動物的飲水和采食進行給藥，其給藥方便并且安全性高同時在對動物進行免疫保護的同時幾乎不會對動物造成任何應激。

然而，反芻動物的消化系統形態構造較單室胃動物的復雜，其瘤胃具有強大的發酵消化作用，常規的口服疫苗在給藥前不經過保護處理，使得口服疫苗極有可能在其消化道中降解從而失去效力。微囊化技術可以很好的保護抗原抵御消化道各段的降解，微囊化口服疫苗是采用天然或合成的高分子材料對抗原進行包被，從而控制抗原在整個免疫程序中的釋放程度，最終保證抗原在抵達靶細胞時具有一定的免疫效力。微囊化大腸桿菌口服疫苗是新型致瀉性大腸桿菌疫苗，該口服疫苗可以方便快捷的對動物進行免疫接種，減輕了接種人員的工作強度，克服了注射接種對動物造成應激的缺點，并且利用微囊化技術對抗原進行保護使得口服疫苗能夠最大化的發揮其效力。但目前尚無針對微囊包被的口服疫苗免疫抗體進行檢測的準確、特異的檢測方法來評價微囊包被的口服疫苗免疫動物后的體液免疫效果，故本發明研究建立了微膠囊大腸桿菌口服疫苗免疫抗體檢測檢測方法。

目前，該病抗體水平的檢測方法主要有微量凝集試驗和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等方法，其中ELISA法具有操作簡便、特異性強、結果穩定等優點，是診斷和監測羊大腸桿菌病的行之有效的方法之一。缺點是直接ELISA法實驗中的一抗都得用酶標記，但不是每種酶都適合做標記，費用相對較高；間接ELISA法實驗中交互反應發生的幾率較高。商品化的ELISA檢測方法目前可檢測的抗體中沒有特定針對微囊化滅活口服疫苗刺激機體后而產生。

并且，常規ELISA檢測法監測抗體的方法存在著抗原來源不明確、在進行大規模鑒別檢測抗體水平時成本較高，又因，微囊化大腸桿菌口服疫苗尚未商品化，用于針對此疫苗抗體水平檢測的方法及相關示范法也未見報道。所以，利用新型致瀉型大腸桿菌微囊化口服疫苗達到動物機體對致病型大腸桿菌此抗原產生免疫保護過程中抗體水平的監測是需要借鑒流行病學研究，創建實用、簡便、經濟、靈敏度高的新診斷體系。

間接ELISA檢測技術是目前在動物疾病研究領域應用十分廣泛。操作簡便，靈敏度高，還可對抗體水平做出定量分析。間接ELISA法是檢測抗體常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，間接ELISA法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。

間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。被免動物血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質再包被一次，以封閉固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中樣本須先行稀釋，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。本檢測方法針對間接ELISA法的相關特點均做出相關優化，以利于檢測方法的特異性提升并且靈敏度高的加強。

在前期工作基礎上，選取致病型大腸桿菌菌株C83-1、C83-2、C83-3，血清型(O78:K80)做為抗原。在上述基礎，在試劑用量、體系建立、條件的優化及配套組裝檢測方法等方面進行探討，最終研發了微膠囊大腸桿菌口服疫苗免疫抗體檢測檢測方法。用其快速、特異、價廉的診斷試劑，進行檢測免疫動物抗體水平，為防治致瀉型羊大腸桿菌病對養羊業的危害和畜牧業的健康發展提供新技術支撐。

發明內容