[發明專利]一種依賴核酸內切酶活性的核酸等溫檢測技術和試劑

在審

• 申請號: 201610220409.3
• 申請日: 2016-04-07
• 公開（公告）號: CN105671191A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 劉寅;楊振;文浩;王寧;于佳
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種核酸檢測技術，具體而言是一種依賴核酸內切酶活性的核酸檢測技術和試劑。

背景知識

核酸等溫檢測技術是核酸體外檢測技術的一種，其反應過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加等溫擴增DNA聚合酶和各自特異性引物以及其他輔助酶類或報告基團來達到快速核酸擴增的目的。由于等溫擴增的產物結構復雜，一般不適合用于分子克隆，主要用于核酸體外診斷。核酸等溫擴增技術由于不需要使用PCR儀等專用設備，因此適合在基層醫院和簡易實驗室中推廣使用，因此近幾年發展迅速。常見的等溫擴增技術主要包括：環介導核酸等溫擴增技術(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)、滾環擴增技術(RollingCircleAmplification，RCA)、單引物等溫擴增技術(SinglePrimerIsothermalAmplification，SPIA)、依賴解旋酶恒溫擴增技術(Helicase-dependentIsothermalDNAAmplification，HDA)、依賴核酸序列的擴增(NucleicAcidSequenceBasedAmplification，NASBA)、鏈替代擴增(StrandDisplacementAmplification，SDA)、快速等溫檢測放大技術(RapidIsothermalDetectionandAmplification，RIDA)、交叉引物等溫擴增(Crossprimingamplification，CPA)等。

上述方法可以分為三大類，第一類以RCA為代表的多步反應等溫擴增檢測方法，包括RCA、SPIA等。該類方法的特點是在反應過程中先通過一步反應合成檢測中間體，而后對其進行等溫擴增，實現核酸檢測。以RCA為例，該技術是于1998年模擬自然界微生物環狀DNA的滾環復制過程，發展起來的一種放大信號和靶核酸相結合的檢測方法。先根據引物特異性，合成DNA環，作為等溫擴增中間體，而后在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下由一條引物與環形DNA模板的鏈置換合成，實現環狀DNA模板的體外等溫線性擴增。依據擴增過程中加入的引物不同可分為線性擴增、指數擴增、多引物擴增和信號擴增等。該類檢測方法的缺點在于，需要多步反應才能得到檢測結果，檢測方法繁瑣，費用較高，也較為費時，檢測靈敏度也較低。

第二類，以LAMP為代表的多引物依賴于鏈置換酶活性的等溫擴增檢測技術，該類技術主要包括LAMP、CPA等。上述技術的核心是通過巧妙的引物設計，不需要使用連接酶等輔助酶直接通過擴增產生等溫擴增中間體。進而依靠引物組擴增中間體上的特定片段，通過檢測擴增產物實現核酸檢測。以LAMP為例，該方法針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用BstDNA聚合酶在等溫條件下擴增出雙發卡狀中間體，進而進入循環實現鏈增長，最終的產物為不同級數的擴增產物的混合物。反應產物可通過電泳或者根據擴增副產物焦磷酸鎂沉淀形成的濁度或者熒光染料進行判斷。此類方法具有快速、高靈敏度的特點但是由于氣溶膠污染的原因，該類方法的假陽性結果較多，另外在進行引物設計時，要求目的片段在300bp之內具有150bp左右的保守序列，引物設計繁瑣，而且在高突變率的RNA病毒基因組中，這樣的序列是很難找到的，粗放的引物設計容易導致假陰性，這極大地限制了該方法的應用。

第三類，以RIDA為代表的不進行擴增的核酸檢測技術。該類方法不依靠核酸擴增產生檢測信號，而通過分子燈標的方法進行檢測。以RIDA為例，該方法通過核酸切刻酶的活性，將和檢測目的序列結合的分子燈標切開，產生熒光信號進行檢測。該類方法由于核酸切刻酶種類有限，因此對目的序列限制較大。而且只能切刻DNA雙鏈，不能直接檢測RNA，因而并沒有得到廣泛的應用。

總之，核酸等溫擴增技術在檢驗醫學中體現出的最大的優勢在于操作簡單，檢測時間較短，不需要依賴大型設備等幾個方面。而目前的等溫檢測方法依然存在著一些缺欠，第一類技術方法由于需要在體系中加入連接酶、解旋酶等物質，需要多步反應完成，無法體現出操作簡便的優勢。第二類方法則對目的片段的保守性要求過高，引物設計復雜，容易引起氣溶膠污染，其應用也受到了一定的限制。第三類方法還處于發展初期，RIDA方法需要切刻酶參與對檢測目的序列提出了更高的要求，也沒有得到廣泛的應用。