[發(fā)明專利]山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離純化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610220146.6
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105647857A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 凌英會;王康巖;朱龍;章孝榮;張運海;李運生;吳昊;睢夢華;鄭琪
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 合肥市長遠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34119
• 代理人: 程篤慶;黃樂瑜

1.山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離純化方法，包括以下步驟：

(1)采集山羊肌肉組織，先用酒精清洗消毒，再用生理鹽水沖洗后放入 DMEM/F12培養(yǎng)基中，于12h之內(nèi)進行骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離；

(2)用含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗肌肉組織，將其剪成0.5× 0.5cm的大組織塊；

(3)將獲得的大組織塊放入培養(yǎng)皿中，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA進行消化， 保證胰蛋白酶能夠完全沒過大組織塊，4℃條件下靜置12h，加入增殖培養(yǎng)基 終止消化；之后將培養(yǎng)皿中的大組織塊連同培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50ml的離心管內(nèi)， 1000r/min離心8min，吸除上清液，再用增殖培養(yǎng)液重懸，用無菌吸管將大組 織塊及培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中；

(4)將步驟(3)得到的大組織塊再剪成0.5～1mm³的小組織塊，再加入適 量的增殖培養(yǎng)液，將小組織塊均勻地鋪開在培養(yǎng)皿中，各小組織塊之間的間距 在3mm，吸去培養(yǎng)基，待小組織塊充分吸附于培養(yǎng)瓶后，再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來 觀察小組織塊是否充分吸附于培養(yǎng)瓶上，再慢慢加入預(yù)熱至37℃的培養(yǎng)液， 重新置于細胞培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生 長情況，每兩天更換培養(yǎng)液；待細胞長至80％～90％匯合度時，吸去培養(yǎng)瓶中 舊培養(yǎng)液，用預(yù)熱至37℃的PBS清洗細胞，以去除殘余的血清和組織塊及死 細胞，重復(fù)2次，從而得到未純化的山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞；

(5)采用差速貼壁法進行原代山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的純化：首先將步驟(4) 得到的未純化貼壁細胞用DPBS洗滌3次，胰酶消化3min，加入2倍體積增殖 培養(yǎng)液終止消化；1500r/min離心7min，收集細胞，加入增殖培養(yǎng)液重懸；按 5×10⁴～8×10⁴個接種至事先包被有明膠的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)1h，當(dāng)有大量細胞貼 壁時取上層未貼壁的懸浮細胞重新接種至新的培養(yǎng)皿上，此時貼壁的細胞主要 為成纖維細胞，由于骨骼肌衛(wèi)星細胞的貼壁速度較慢，此步驟重復(fù)2～3次， 第4天換液，去除血細胞及未貼壁的死細胞，并觀察細胞生長情況，此后連續(xù) 5天進行骨骼肌衛(wèi)星細胞的純化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述青霉 素的濃度為500IU/ml，所述鏈霉素的濃度為500μg/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述增殖 培養(yǎng)基的成分為80％DMEM/F12+10％胎牛血清+10％馬血清。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，加入3ml 的0.25％胰蛋白酶-EDTA進行消化。