[發明專利]一種酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法在審
| 申請號： | 201610219039.1 | 申請日： | 2016-04-08 |
| 公開（公告）號： | CN105695552A | 公開（公告）日： | 2016-06-22 |
| 發明（設計）人： | 趙林果;趙東霞;解靜聰;裴建軍;李琦;房仙穎 | 申請（專利權）人： | 南京林業大學 |
| 主分類號： | C12P33/20 | 分類號： | C12P33/20;C12N9/42;C12N9/24;C12N15/70;C12N15/66 |
| 代理公司： | 南京經緯專利商標代理有限公司 32200 | 代理人： | 唐循文 |
| 地址： | 210037 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 法制 稀有 人參 皂苷 rh1 方法 | ||
1.一種酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法，其特征在于利用來源于Thermotogapetrophila的 β-葡萄糖苷酶和黑曲霉(Aspergillusniger)的α-鼠李糖苷酶，降解人參皂苷Re生產Rh1。
2.權利要求1所述酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法，其特征在于β-葡萄糖苷酶的核苷酸序 列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.權利要求1所述酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法，其特征在于α-鼠李糖苷酶的核苷酸序 列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
4.權利要求1所述酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶是通過 重組表達制備的，步驟為：
(1)以提取的Thermotogapetrophila基因組DNA為模板，用具有SEQIDNO:5所示的 核苷酸序列為上游引物和具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴增得到β- 葡萄糖苷酶的DNA分子；
(2)將上述β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分別用NdeI和XhoI進行雙酶切， 連接并轉化得到含有β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重組質粒；
(3)將上述獲得的重組質粒轉化表達宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導β-葡萄糖苷酶 表達，收集菌體，破碎細胞，80℃熱處理40分鐘，獲得純化的β-葡萄糖苷酶。
5.權利要求1所述酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法，其特征在于所述α-鼠李糖苷酶是通過 重組表達制備的，步驟為：
(1)以提取的黑曲霉(Aspergillusniger)NL-1cDNA為模板，用具有SEQIDNO:7所 示的核苷酸序列為上游引物和具有SEQIDNO:8所示的核苷酸序列為下游引物，PCR擴增得 到α-鼠李糖苷酶的DNA分子；
(2)將上述β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分別用NdeI和XhoI進行雙酶切， 連接并轉化得到含有α-鼠李糖苷酶的DNA分子的重組質粒；
(3)將上述獲得的重組質粒轉化表達宿主E.coliBL21(DE3)，誘導α-鼠李糖苷酶表達， 收集菌體，破碎細胞，離心獲α-鼠李糖苷酶。
6.根據權利要求1所述酶法制備稀有人參皂苷Rh1的方法，其特征在于降解條件為：
(1)1g/L人參皂苷Re，β-葡萄糖苷酶0.2U，pH5.0，85℃條件下，降解1h；
(2)將上述反應液加入α-鼠李糖苷酶6.6U，調整pH為6.5，35℃條件下，降解1h，最 終可以將人參皂苷Re轉化為人參皂苷Rh1，摩爾得率為95％。
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