[發明專利]一種基于電還原氧化石墨烯和納米金修飾電極的DNA傳感器的制備及應用方法

有效

• 申請號: 201610218379.2
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105758918B
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 李光九;鄭雯;劉俐華;王秀麗;陳瑋;王文成;孫偉
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 于躍

1.一種基于電化學還原部分氧化石墨烯和金納米顆粒復合修飾電極的電化學DNA傳感器測試李斯特氏菌特征基因片段的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將石墨粉與離子液體正己基吡啶六氟磷酸鹽以2：1的質量比混合研磨均勻得到離子液體修飾碳糊，然后將離子液體修飾碳糊填入玻璃電極管中壓實，內插銅線作為導線，可得到離子液體修飾碳糊電極(CILE)；

(2)將氯金酸和硝酸鈉以一定比例混合制備電解液，CILE為工作電極，鉑片為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，利用恒電位沉積法在CILE表面得到金納米顆粒，用蒸餾水清洗后得到AuNPs/CILE，真空干燥備用；

(3)在AuNPs/CILE電極上滴涂一定濃度氧化石墨烯(GO)分散液，自然晾干后得到GO修飾的電極(GO/AuNPs/CILE)，然后在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中恒電位還原，一定時間后取出電極用二次蒸餾水充分沖洗，N₂吹干得到p-RGO/AuNPs/CILE；

(4)將p-RGO/AuNPs/CILE浸入含乙基(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的PBS中，以活化修飾電極表面的羧基，然后在電極表面均勻滴涂含有氨基修飾的探針ssDNA序列的緩沖溶液，修飾有氨基的探針序列可以和電極表面的羧基發生共價鍵合反應形成酰胺鍵進而固定ssDNA形成一層穩定的探針，自然晾干后分別使用0.5％的十二烷基磺酸鈉溶液和二次蒸餾水沖洗3次，以除去未吸附的探針序列，即可得到固定有探針序列的電極ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE；

(5)將含有目標序列的PBS直接滴涂在ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE表面，在室溫下雜交后分別用0.5％的SDS溶液和二次蒸餾水沖洗，以除去未雜交的目標序列，雜交后的電極記為dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE；

(6)將雜交后的電極浸入亞甲基藍(MB)溶液中吸附一定時間，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸餾水充分洗滌，使用示差脈沖伏安法測定MB在Tris-HCl緩沖溶液中的電化學行為，循環伏安在1.0mmol/L K₃[Fe(CN)₆]和0.5mol/L KCl混合溶液中進行，掃速100mV/s；電化學交流阻抗在10.0mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4-和0.1mol/L KCl混合溶液中進行，頻率范圍10⁴～0.1Hz；

步驟(1)中所述研磨的時間為1.5h～3h；所述玻璃電極管的內徑為3mm～5mm，兩端用砂紙80^#～1200^#打磨光滑；

步驟(2)中所述的混合制備電解液中氯金酸的濃度為3.0mmol/L，硝酸鈉的濃度為0.1mol/L；所述恒電位沉積法的沉積電位為-0.2V(vs.SCE)，沉積時間為30s；

步驟(3)中所述的氧化石墨烯分散液的濃度為1.0mg/mL，滴涂量為10.0μL，PBS濃度為0.2mol/L，pH為8.0，恒電位還原的電位為-1.3V，時間為150s；

步驟(4)中所述的PBS溶液含EDC濃度為5.0mmol/L和NHS濃度為8.0mmol/L，浸入時間為30min，在電極表面滴涂的含有1.0×10^-6mol/L氨基修飾的探針ssDNA序列的PBS緩沖溶液，pH為7.0，滴涂量為10.0μL；所述探針序列為：5'-NH₂-TGG CGG CAC ATT TGT CAC TGCA-3'；

步驟(5)中所述的含有目標ssDNA序列的PBS的濃度為50.0mmol/L，pH為7.0，滴涂量為10.0μL；所述目標序列為：5'-TGCAGT GACAAATGT GCC GCCA-3'；

步驟(6)中所述MB溶液的濃度為2.0×10^-5mol/L，吸附時間為8min，含有MB的Tris-HCl緩沖溶液的pH為7.0，濃度為50.0mmol/L，示差脈沖伏安法測定儀器條件為電位增量0.008V，脈沖寬度0.05s，脈沖周期0.2s。