[發明專利]雨生紅球藻游動細胞的培養方法及原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 201610218349.1
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105647810B
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 徐曉瑩;程天佑;張維;陳林;劉天中
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 張勇

本發明提供了一種雨生紅球藻游動細胞的培養方法，包括將雨生紅球藻在含有乙酸鈉、酵母提取物和其他無機營養的培養基中進行培養的步驟。通過具有特定成分的培養基培養可獲得高達85％以上的游動細胞，細胞密度可達10⁵個/ml以上。本發明還提供了一種利用游動細胞制備原生質體的方法，在含有膠原蛋白酶Collagenase的酶溶液中處理后可獲得80％以上的原生質體。本發明的細胞培養與原生質體制備過程操作簡單，方便快捷，具有可重復性，原生質體制備率高，活性保持好，有利于后續的原生質體融合與分子生物學操作等工作。

技術領域

本發明涉及一種雨生紅球藻游動細胞的培養方法及原生質體的制備方法。

背景技術

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)被公認為自然界中生產天然蝦青素(3，3’-二羥基-β，β’-類胡蘿卜素-4，4’-二酮)的最好生物。蝦青素是一種生物活性物質，具有抗氧化、消除自由基、增強動物免疫、促進繁殖、生長、成熟等作用，被應用于醫藥、水產養殖等各個領域。近年來，雨生紅球藻已應用于大規模的自養培養中，但由于雨生紅球藻為自養型生物，導致其在培養過程中存在生長緩慢、生物量低、培養條件要求高等問題，嚴重制約了雨生紅球藻大規模商業化高密度培養。利用現代微生物育種技術選育性狀優良的藻株已日益受到關注。原生質體融合、基因工程等育種技術已成為選育優良藻株的有效手段。因此，建立高效的雨生紅球藻原生質體的制備技術及其重要。

雨生紅球藻的生活周期主要分為進行營養生長的綠色游動細胞時期和積累紅色蝦青素的不動細胞時期。當環境適宜(如低光照、營養鹽充足等)時，細胞為綠色細胞并且大量繁殖。當細胞處于脅迫條件(如高光照、營養鹽缺乏、高C/N等)時，細胞壁增厚、體積增大、細胞增殖減慢，且因積累大量蝦青素而呈紅色。雨生紅球藻生長十分緩慢，Harker等曾在30L的氣升式(air-lift)光反應器中用光和自養方法(不添加有機碳源)培養雨生紅球藻，三周的時間內，生物量僅達到10⁵個/ml。

藻類的細胞操作可以追溯到50年代末期，Fushs(1958)利用絲狀藍藻——顫藻(Oscillatoria amoena)制備得到原生質體。到70年代中后期，其他種類藻原生質體的制備也相繼獲得成功：Kobayashi用機械法擠壓出羽藻(Bryopsis hypnoides)的原生質體；1986年，Cheney分離得到江籬(Gracilaria verrucosa)的原生質體，并培養成株；1989年，周一紅和王素娟用生物技術手段分離獲得鷓鴣菜(Caloglossalep rieurii)原生質體并培養成株。1990年，Saga和Sakai分離到海帶(Laminaria Japonica)、巨藻(Macrocystis)和馬尾藻(Sargassum horueri)的原生質體，并把巨藻和馬尾藻的原生質體培養成株。1993年，Gall等分離到了長紫菜(porphyra crispata)的原生質體，并觀察了其中間及最終再生形態。1996年，查向東等利用褐藻膠酶和纖維素酶獲得裙帶菜配子體原生質體，并經4-5周再生成為同普通配子體大小和形狀相同的新的配子體。

早期酶法制備原生質體過程中的酶主要來源于生物體內，如微生物來源的海藻解壁酶、動物來源的海藻解壁酶。目前，廣泛用于原生質體制備的酶主要有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、幾丁質酶、蛋白酶、崩潰酶、離析酶等。范寰等(一種白腐真菌的原生質體制備方法，中國專利200910228483X)采用蝸牛酶酶解分離一種酵母菌的原生質體，β-巰基乙醇預處理條件下，原生質體形成率可達90％-96％。

根據不同藻類細胞壁成分的不同，各種多糖水解酶如纖維素酶、蝸牛酶、果膠酶、離析酶等被廣泛應用于微藻原生質體的制備中。魏東等(葡萄藻原生質體的制備及葡萄藻原生質體制備率檢測方法，中國專利201410312883X)提出采用纖維素酶、果膠酶及離析酶的復合酶溶液來制備葡萄藻原生質體的方法，但并未提及制備效率。