[發明專利]一種利用高粱花葉病毒P3N?PIPO構建的亞細胞定位試劑盒

有效

• 申請號: 201610217176.1
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105823890B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 楊永慶;程光遠;彭磊;徐倩;董萌;徐景升;翟玉山;鄧宇晴;鄭艷茹;高世武;郭晉隆
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66
• 代理公司: 福州市眾韜專利代理事務所(普通合伙)35220
• 代理人: 陳智雄,黃秀婷

1.一種熒光蛋白標記的PD定位載體的制備方法，其特征在于：

(1)針對SrMV-P3的編碼序列設計特異PCR引物SrMV-P3-F和SrMV-P3-R，以SrMV的cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收，獲得SrMV-P3的編碼序列；所述SrMV-P3-F的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；SrMV-P3-R的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；SrMV-P3編碼序列的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

(2)設計特異PCR引物SrMV-P3N-F和SrMV-P3N-R，在SrMV-P3N-F中引入酶切位點Xho I；以SrMV-P3編碼序列為模板，使用引物SrMV-P3N-F和SrMV-P3N-R進行PCR擴增，PCR反應結束后，將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收并濃縮至400ng/μL，獲得SrMV-P3N的編碼序列；所述SrMV-P3N-F的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；SrMV-P3N-R的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；SrMV-P3N編碼序列的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

(3)SrMV-PIPO編碼序列的獲得：設計特異PCR引物SrMV-PIPO-F和SrMV-PIPO-R，在SrMV-P3N-R中引入酶切位點Hind III；以SrMV-P3編碼序列為模板，使用引物SrMV-PIPO-F和SrMV-PIPO-R進行PCR擴增，PCR反應結束后，將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，回收并濃縮至400ng/μL，獲得SrMV-PIPO的編碼序列；所述SrMV-PIPO-F的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；SrMV-PIPO-R的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；SrMV-PIPO編碼序列的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；

(4)SrMV-P3N-PIPO編碼序列的獲得：將濃度均為400ng/μL的P3N和PIPO的PCR產物按照1︰1混合作為模板，使用引物SrMV-P3N-F和SrMV-PIPO-R，利用融合PCR方法克隆SrMV-P3NPIPO編碼序列；PCR反應結束后，將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收，獲得SrMV-P3N-PIPO的編碼序列；所述SrMV-P3N-PIPO編碼序列的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；

(5)插入片段S的獲得：使用Xho I和Hind III對SrMV-P3N-PIPO編碼序列進行雙酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收，獲得插入片段S；所述插入片段S的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；

(6)熒光蛋白標記的PD定位載體的獲得：使用Xho I和Hind III分別對載體pSAT6-EGFP-C1、pSAT6-ERFP-C1、pSAT6-EYFP-C1和pSAT6-ECFP-C1進行雙酶切，將酶切產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離并回收；然后用T4DNA連接酶將酶切產物與插入片段S連接，并將連接產物轉化至感受態大腸桿菌DH5α中，挑取陽性克隆驗證，分別獲得的熒光蛋白標記PD定位載體pSrMV-P3N-PIPO-GFP、pSrMV-P3N-PIPO-RFP、pSrMV-P3N-PIPO-YFP、pSrMV-P3N-PIPO-CFP；所述插入片段S的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。

2.一種包含利用權利要求1所述方法制備得到的熒光蛋白標記的PD定位載體的亞細胞定位試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成：

(1)綠色熒光蛋白標記的PD定位載體pSrMV-P3N-PIPO-GFP，作為陽性對照，1管，100ng/μL，50μL/管，-20℃冷凍保存備用；

(2)紅色熒光蛋白標記的PD定位載體pSrMV-P3N-PIPO-RFP，作為陽性對照，1管，100ng/μL，50μL/管，-20℃冷凍保存備用；

(3)黃色熒光蛋白標記的PD定位載體pSrMV-P3N-PIPO-YFP，作為陽性對照，1管，100ng/μL，50μL/管，-20℃冷凍保存備用；

(4)青色熒光蛋白標記的PD定位載體pSrMV-P3N-PIPO-CFP，作為陽性對照，1管，100ng/μL，50μL/管，-20℃冷凍保存備用；

(5)載體pSAT6-EGFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷凍保存備用；

(6)載體pSAT6-ERFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷凍保存備用；

(7)載體pSAT6-EYFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷凍保存備用；

(8)載體pSAT6-ECFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷凍保存備用；

(9)限制性內切酶Xho I：1管，500units，100μL/管；

(10)限制性內切酶Hind III：1管，500units，100μL/管；

(11)無RNase水：2瓶，100mL/瓶；

(12)侵染液：1管，50mL/管，-20℃冷凍保存備用。