[發明專利]用于分離獲得肺臟干細胞的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201610216939.0
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN107267437B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 張婷
• 申請（專利權）人: 蘇州吉美瑞生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/073;C12N13/00
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種分離獲得肺臟干細胞的方法，所述方法用于非治療目的，其特征在于，包括以下步驟：

利用組織消化液將包含肺臟干細胞的生物樣本進行消化處理，以便獲得單細胞；以及

將所述單細胞與肺臟干細胞分離培養液混合，并置于經過增殖抑制處理的胚胎成纖維細胞上進行孵育培養，以便獲得肺臟干細胞，

其中，所述組織消化液包含：99體積％的PBS；0.1-2U/ml DNA酶；0.1-0.2mg/ml I型膠原酶；0.1-0.2mg/ml IV型膠原酶；0.04-0.1mg/ml分散酶；0.1-0.5mg/ml蛋白酶XIV；0.1-3mg/ml鏈絲菌蛋白酶E；以及0.2-0.5mg/ml胰酶，

所述肺臟干細胞分離培養液包含：90體積％的RPMI1640培養基；10體積％的胎牛血清；1-3mmol/L L-谷氨酰胺；0.05-0.15mmol/Lβ-巰基乙醇；100-1000U/ml白血病抑制因子；以及2-5ng/ml EGF生長因子，

所述生物樣本為肺臟組織，所述肺臟組織由遠端支氣管采樣獲得。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織消化液包含：99體積％的PBS；1U/ml DNA酶；0.15mg/ml I型膠原酶；0.15mg/ml IV型膠原酶；0.07mg/ml分散酶；0.3mg/ml蛋白酶XIV；2mg/ml鏈絲菌蛋白酶E；以及0.35mg/ml胰酶。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺臟干細胞分離培養液包含：90體積％的RPMI1640培養基；10體積％的胎牛血清；2mmol/L L-谷氨酰胺；0.1mmol/Lβ-巰基乙醇；500U/ml白血病抑制因子；以及3.5ng/ml EGF生長因子。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過下列任意一種方法制備獲得所述經過增殖抑制處理的胚胎成纖維細胞：

(1)將胚胎成纖維細胞進行輻照量為30-80Gy的輻照處理1-5小時；

(2)將所述胚胎成纖維細胞進行1-30ug/ml絲裂霉素C處理1-5小時。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述胚胎成纖維細胞來源于小鼠。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述胚胎成纖維細胞來源于E13.5小鼠。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述輻照處理是利用細胞輻照儀進行的。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，于36-38攝氏度條件下進行所述消化處理1-5小時。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，于37攝氏度條件下進行所述消化處理1-5小時。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在進行所述消化處理時，針對少于0.1mg的包含肺臟干細胞的生物樣本，每個生物樣本加入1ml組織消化液；針對不少于0.1mg的包含肺臟干細胞的生物樣本，每立方厘米的生物樣本加入2.5ml組織消化液。

11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述單細胞與所述肺臟干細胞分離培養液的混合比例為300000細胞/2ml分離培養液，其中單細胞數量不足300000時按照300000計算。

12.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，于36-38攝氏度，4％-6.5％CO₂的條件下進行所述孵育培養2-5天。

13.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包括：

對所述肺臟干細胞進行細胞鑒定和污染檢測。

14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染檢測包括細菌污染檢測和支原體污染檢測。

15.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，利用免疫熒光染色法檢測所述肺臟干細胞的Krt5和P63標志物的表達，以便實現所述細胞鑒定。