[發(fā)明專利]用于分離獲得肺臟干細(xì)胞的試劑盒及方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610216939.0
• 申請(qǐng)日: 2016-04-08
• 公開（公告）號(hào): CN107267437B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州吉美瑞生醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/073;C12N13/00
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種分離獲得肺臟干細(xì)胞的方法，所述方法用于非治療目的，其特征在于，包括以下步驟：

利用組織消化液將包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本進(jìn)行消化處理，以便獲得單細(xì)胞；以及

將所述單細(xì)胞與肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液混合，并置于經(jīng)過增殖抑制處理的胚胎成纖維細(xì)胞上進(jìn)行孵育培養(yǎng)，以便獲得肺臟干細(xì)胞，

其中，所述組織消化液包含：99體積％的PBS；0.1-2U/ml DNA酶；0.1-0.2mg/ml I型膠原酶；0.1-0.2mg/ml IV型膠原酶；0.04-0.1mg/ml分散酶；0.1-0.5mg/ml蛋白酶XIV；0.1-3mg/ml鏈絲菌蛋白酶E；以及0.2-0.5mg/ml胰酶，

所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液包含：90體積％的RPMI1640培養(yǎng)基；10體積％的胎牛血清；1-3mmol/L L-谷氨酰胺；0.05-0.15mmol/Lβ-巰基乙醇；100-1000U/ml白血病抑制因子；以及2-5ng/ml EGF生長(zhǎng)因子，

所述生物樣本為肺臟組織，所述肺臟組織由遠(yuǎn)端支氣管采樣獲得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組織消化液包含：99體積％的PBS；1U/ml DNA酶；0.15mg/ml I型膠原酶；0.15mg/ml IV型膠原酶；0.07mg/ml分散酶；0.3mg/ml蛋白酶XIV；2mg/ml鏈絲菌蛋白酶E；以及0.35mg/ml胰酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液包含：90體積％的RPMI1640培養(yǎng)基；10體積％的胎牛血清；2mmol/L L-谷氨酰胺；0.1mmol/Lβ-巰基乙醇；500U/ml白血病抑制因子；以及3.5ng/ml EGF生長(zhǎng)因子。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過下列任意一種方法制備獲得所述經(jīng)過增殖抑制處理的胚胎成纖維細(xì)胞：

(1)將胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行輻照量為30-80Gy的輻照處理1-5小時(shí)；

(2)將所述胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行1-30ug/ml絲裂霉素C處理1-5小時(shí)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述胚胎成纖維細(xì)胞來源于小鼠。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述胚胎成纖維細(xì)胞來源于E13.5小鼠。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述輻照處理是利用細(xì)胞輻照儀進(jìn)行的。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，于36-38攝氏度條件下進(jìn)行所述消化處理1-5小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，于37攝氏度條件下進(jìn)行所述消化處理1-5小時(shí)。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行所述消化處理時(shí)，針對(duì)少于0.1mg的包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本，每個(gè)生物樣本加入1ml組織消化液；針對(duì)不少于0.1mg的包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本，每立方厘米的生物樣本加入2.5ml組織消化液。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單細(xì)胞與所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液的混合比例為300000細(xì)胞/2ml分離培養(yǎng)液，其中單細(xì)胞數(shù)量不足300000時(shí)按照300000計(jì)算。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，于36-38攝氏度，4％-6.5％CO₂的條件下進(jìn)行所述孵育培養(yǎng)2-5天。

13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括：

對(duì)所述肺臟干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定和污染檢測(cè)。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染檢測(cè)包括細(xì)菌污染檢測(cè)和支原體污染檢測(cè)。

15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，利用免疫熒光染色法檢測(cè)所述肺臟干細(xì)胞的Krt5和P63標(biāo)志物的表達(dá)，以便實(shí)現(xiàn)所述細(xì)胞鑒定。