[發明專利]檢測中華鱉細小病毒的特異性引物、探針及快速檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201610216402.4
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN105624336B
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 潘曉藝;袁雪梅;沈錦玉;藺凌云;姚嘉赟;徐洋;尹文林
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種檢測中華鱉細小病毒的特異性引物、探針及快速檢測試劑盒，其中，中華鱉細小病毒鏈置換等溫擴增可視化快速檢測試劑盒包含引物組A，中華鱉細小病毒熒光定量檢測試劑盒包括特異性引物組B和Taqman熒光探針C；本發明采用鏈置換酶、等溫擴增和熒光定量技術，通過檢測中華鱉細小病毒的衣殼蛋白基因，來檢測中華鱉細小病毒，這是目前國內外首次研制檢測中華鱉細小病毒的引物組和試劑盒。該試劑盒的研制為中華鱉細小病毒病的監測和預防奠定基礎。

技術領域

本發明屬于靶DNA片斷的快速檢測領域，具體地說，涉及一種檢測中華鱉細小病毒的特異性引物、探針及快速檢測試劑盒。

背景技術

中華鱉細小病毒(Trionyx sinensis Dependoparvovirus，TSDPV)是引起中華鱉大量死亡的致病性病毒，常引起中華鱉肝炎、腸道卡他性炎癥和胰臟點狀壞死，對中華鱉養殖產業危害極大。TSDPV為單鏈DNA病毒，屬于細小病毒目細小病毒科細小病毒亞科依賴性細小病毒屬，該病毒是目前發現能夠感染中華鱉的第二個DNA病毒。該病毒于2012年從患肝炎和腸炎的中華鱉中分離獲得，其造成中華鱉在養殖期大量死亡，死亡率一般為60～70％，嚴重的達到85％以上，近幾年造成的經濟損失無法估量。該病毒在國內外未見報道，由于該病毒至今未有檢測試劑盒和檢測方法，嚴重阻礙了該病毒引起疾病的預防工作，因此該病毒檢測試劑盒的開發和檢測技術的研究顯得尤為重要。

發明內容

有鑒于此，本發明針對上述問題，提供了一種檢測中華鱉細小病毒的特異性引物、探針及快速檢測試劑盒，本發明的引物、探針和試劑盒特異性強，敏感性高，能實現快速、有效且準確檢測中華鱉細小病毒；本發明中的兩種試劑盒分別為鏈置換等溫擴增可視化快速檢測試劑盒和熒光定量檢測試劑盒，兩種試劑盒都是在封閉的情況下判斷結果，擴增產物不會對檢測環境造成污染，可用于中華鱉細小病毒病的監測和早期預防。本發明采用鏈置換酶、等溫擴增和熒光定量技術，通過檢測中華鱉細小病毒的衣殼蛋白基因，來檢測中華鱉細小病毒，這是目前國內外首次研制檢測中華鱉細小病毒的試劑盒；該試劑盒的研制為中華鱉細小病毒病的監測和預防奠定基礎。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種檢測中華鱉細小病毒的特異性引物組A，該引物組A包含引物TSDPV-F3、引物TSDPV-B3、引物TSDPV-FIP和引物TSDPV-BIP，

引物TSDPV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

引物TSDPV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

引物TSDPV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

引物TSDPV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本發明還公開了一種檢測中華鱉細小病毒的引物探針混合物，其由引物組B和Taqman熒光探針C組成，探針C的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。

進一步地，引物組B包含引物TSDPV-q165F和引物TSDPV-q165R；

引物TSDPV-q165F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

引物TSDPV-q165R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

探針的C的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

進一步地，熒光報告基團選自6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的一種或幾種；所述熒光淬滅基團選自6-羧基四甲基羅丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬滅劑1、黑洞淬滅劑2或黑洞淬滅劑3中的一種或幾種。