[發(fā)明專利]一種臍血NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法及其試劑盒與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610214351.1
• 申請日: 2016-04-07
• 公開（公告）號: CN107267454A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 武曉云;劉學(xué)敏;康會彥;王云虹;樊曉翔;李志剛;丁煒;武立華;李金艷;沈殿富;張慧珍
• 申請（專利權(quán)）人: 北京京蒙高科干細(xì)胞技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京尚誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11322
• 代理人: 魯兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種臍血NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法及其試劑盒與其在制備腫瘤免疫治療藥物及腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

自然殺傷細(xì)胞(Nature killer cell，NK)是除T、B細(xì)胞之外的第三類淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)也與T、B細(xì)胞不同，NK細(xì)胞是胞漿中含嗜天青顆粒的大顆粒淋巴細(xì)胞，廣泛存在于淋巴器官和外周組織中，在正常外周血中約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的5％-10％，脾中占1％-2％，淋巴結(jié)和骨髓中也有NK細(xì)胞存在。NK細(xì)胞作為人體天然免疫的重要組成部分，是機(jī)體抗御感染和防止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在免疫監(jiān)視、免疫防御中起著十分重要的作用。長期以來的研究表明在某些疾病的發(fā)生過程中，如腫瘤、自身免疫性疾病、衰老相關(guān)性疾病和HIV感染等，會導(dǎo)致NK細(xì)胞比例、數(shù)量和功能降低。2012年美國疾病控制中心報告NK細(xì)胞的活力和數(shù)量是人體健康的重要保證，幾乎所有疾病的發(fā)病都與NK細(xì)胞的活性明顯不足有關(guān)。當(dāng)人們患有某種疾病時，無論是慢性的、偶發(fā)性的或是急性的，NK細(xì)胞的活性都在平均水平以下。讓NK細(xì)胞恢復(fù)到高水平的活性，是比較好的治療疾病方法。與T淋巴細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不需預(yù)先刺激就可直接溶解破壞腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，通過分泌穿孔素、絲氨酸蛋白酶如顆粒酶A和B、硫酸軟骨素蛋白聚糖等分子降解細(xì)胞膜、破壞靶細(xì)胞完整性而發(fā)揮溶細(xì)胞效應(yīng)；NK細(xì)胞表面表達(dá)FasL(Fas ligand)和TRAIL(TNF-related opoptosis-inducing ligand)可通過與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合引起靶細(xì)胞的凋亡；活化后NK細(xì)胞會釋放大量的干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子；另外通過細(xì)胞膜FcγRIII(CD16)與抗體Fc段結(jié)合從而介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用。隨著對NK細(xì)胞生物功能及活化機(jī)制的了解，利用NK細(xì)胞為靶點(diǎn)的免疫治療對疾病的早期預(yù)防、控制和治療具有重要意義。

近年來，免疫治療己經(jīng)成為繼手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌治療之后的第四大治療模式，并逐漸受到重視。過繼性細(xì)胞免疫治療法作為免疫治療方法的一種，在臨床研究方面取得了較大的進(jìn)展。目前已經(jīng)開展自體NK細(xì)胞過繼免疫治療應(yīng)用于血液腫瘤(急性髓系白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病等)和實(shí)體瘤(腦膠質(zhì)瘤、腎癌和惡性黑色素瘤)的臨床研究，安全性得到肯定，但臨床試驗的結(jié)果并不盡如人意，將自體外周血進(jìn)行 NK細(xì)胞分選后回輸，觀察到體內(nèi)NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷增強(qiáng)，但是生存率和復(fù)發(fā)率與對照組相比并無改善，可能與腫瘤在發(fā)展過程中容易對自體NK細(xì)胞形成免疫逃避有關(guān)，而且NK細(xì)胞過繼性免疫治療的臨床試驗受試者往往都是經(jīng)過多種化療失敗的極度晚期的患者，瘤負(fù)荷重，機(jī)體免疫力差，NK細(xì)胞的功能有嚴(yán)重缺陷。要提高NK細(xì)胞的臨床治療療效就必須改變以往的治療策略。為了克服這些缺陷，異體來源的NK細(xì)胞是一個比較好的選擇。有學(xué)者研究通過移植異體NK細(xì)胞治療白血病患者，發(fā)現(xiàn)能延緩復(fù)發(fā)，且不引起移植物抗宿主病，引起人們對NK細(xì)胞的同種異體反應(yīng)性的關(guān)注。從目前的臨床研究的結(jié)果來看，異源性NK細(xì)胞在完全緩解率、無事件生存期、復(fù)發(fā)和死亡率方面明顯優(yōu)于自體NK細(xì)胞，而且異源性NK細(xì)胞并不伴隨移植物抗宿主反應(yīng)。NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力依賴于NK細(xì)胞表面活化性受體和抑制性受體間的信號平衡調(diào)控，殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIR)組成與主要組織相容性I類(MHC-I)結(jié)合的受體家族，對調(diào)節(jié)人NK細(xì)胞的活化閾值起重要作用。最近越來越多的研究表明利用KIR受體/MHC-I配體的錯配，篩選最優(yōu)的供體能大大增強(qiáng)NK細(xì)胞對受體腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，提高NK細(xì)胞過繼免疫治療的效果。當(dāng)前基于KIR的供者選擇對提高造血干細(xì)胞/骨髓的移植和腫瘤的過繼免疫治療方面的研究倍受關(guān)注。異源性NK輸注已經(jīng)成為臨床上NK細(xì)胞過繼免疫治療的新策略(Lim O,Jung MY,Hwang YK,Shin EC:Present and Future of Allogeneic Natural Killer Cell Therapy.Frontiers in immunology 2015,6:286.)。臍血作為現(xiàn)成的異源性資源，無倫理問題，來源豐富，更容易找到最優(yōu)的供者，且臍血中T淋巴細(xì)胞發(fā)育不成熟,多為幼稚細(xì)胞，移植后發(fā)生急性和慢性移植物抗宿主病的幾率低、程度輕，所以臍血已經(jīng)成為異源NK細(xì)胞極具前景的來源(Shaim H,Yvon E:Cord blood:a promising source of allogeneic natural killer cells for immunotherapy.Cytotherapy 2015,17(1):1-2.)。臨床輸注NK細(xì)胞，需要足夠的細(xì)胞純度和細(xì)胞數(shù)量，但NK細(xì)胞在臍血細(xì)胞中所占比例較低，數(shù)量也很少，需要經(jīng)過體外分離及培養(yǎng)擴(kuò)增，獲得大量高純度的NK細(xì)胞才能滿足臨床應(yīng)用。因而如何獲得高純度、高質(zhì)量的NK細(xì)胞成為NK細(xì)胞過繼免疫治療的關(guān)鍵(Klingemann H:Challenges of cancer therapy with natural killer cells.Cytotherapy 2015,17(3):245-249.)。