[發明專利]用于檢測O型FMDV抗體的固相阻斷ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201610212417.3
• 申請日: 2016-04-07
• 公開（公告）號: CN105675866B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 張杰;王盼;苗銀萍;王軍;魯龍;任寶紅;余清衛;趙林萍
• 申請（專利權）人: 鄭州中道生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京迎碩知識產權代理事務所(普通合伙)11512
• 代理人: 張群峰,呂良

技術領域

本發明涉及一種檢測FMDV抗體的試劑盒，特別涉及一種可用于檢測O型FMDV抗體的固相阻斷ELISA試劑盒，屬于生物制品檢測技術領域。

背景技術

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的急性、高度接觸性傳染病，主要侵害偶蹄動物，偶見于人和其它動物。世界動物衛生組織(Office International des Epizooties，OIE)將其列為法定申報的傳染病，我國將其列一類動物疫病。FMDV在全世界有7個血清型，包括O、A、C、亞洲I(Asia l)、南非I(SAT 1)、南非II(SAT 2)和南非III(SAT 3)，血清型之間無交叉免疫現象。目前我國FMDV流行毒株主要為O型和A型，其中O型FMDV基因型眾多，流行廣泛，嚴重危害畜牧養殖業發展。

我國對FMD采取強制性免疫策略，疫苗免疫效果成為影響FMD防控的關鍵所在。疫苗免疫效果的監測主要有兩種方法，正向間接血凝試驗(IHA)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。IHA簡單易行，但其結果判斷較為主觀，且受血凝抗原影響較大，在國際上已不再使用。ELISA方法操作自動化強，降低了主觀因素干擾，適用于大量臨床樣本的抗體監測。常用ELISA方法包括VP1結構蛋白抗體間接ELISA和液相阻斷ELISA。VP1蛋白抗體間接ELISA是以FMDV的VP1蛋白作為包被抗原捕獲血清特異性抗體，然后通過酶標二抗識別血清抗體，最后經底物顯色進行信號放大。間接ELISA操作簡便，但該方法具有種屬特異性，在臨床上需針對不同宿主制備試劑盒，應用繁瑣。此外，間接ELISA受非特異性因素影響較大，而且只能檢測一種血清抗體，如IgG。

液相阻斷ELISA使用全病毒滅活抗原與血清抗體進行體外中和試驗，然后通過雙抗體夾心法捕獲過剩抗原，最后經酶標二抗進行底物顯色與信號放大。液相阻斷ELISA是OIE推薦的檢測FMDV抗體的標準方法，在世界范圍內應用廣泛。但是該方法也有缺點：(1)使用全病毒滅活抗原，涉及病毒培養、滅活與濃縮純化，對生產條件、生產人員素質和生產過程要求比較嚴格，同時存在生物安全風險；(2)全病毒抗原的制備較為復雜，涉及細胞培養以及病毒繁殖，生產周期長，產量也受限制；(3)全病毒抗原生產需要使用P3實驗室、超速離心機等高端儀器設施，不利于推廣應用。

隨著免疫學的不斷發展進步，基于FMDV中和表位的亞單位疫苗、多肽疫苗等新型疫苗將憑借更高的純度與免疫精準度逐步替代傳統滅活疫苗。與此同時，針對FMDV抗體建立安全、敏感、特異的檢測方法對疫苗的免疫效果監測具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測O型FMDV抗體的間接固相阻斷ELISA試劑盒，利用基因工程技術表達的病毒蛋白作為包被抗原，可針對O型FMDV特異性抗體進行檢測，且不區分樣品宿主來源。

本發明試劑盒的檢測原理是樣品中抗FMDV抗體與包被抗原結合導致兔抗血清與抗原的結合量減少，形成“包被抗原-兔抗血清-酶標抗體”復合物，最后加入底物進行顯色反應，顯色深淺與樣品中抗體含量成反比。

本發明的試劑盒中含有酶標板、洗滌液、樣品稀釋液、兔抗血清、酶標二抗、底物A液、底物B液、終止液、陽性對照血清、陰性對照血清，其中所述酶標板包被有O型FMDV基因工程抗原。

具體地，其中所述酶標板包被O型FMDV基因工程抗原的過程為：用包被緩沖液將抗原稀釋，以100uL/孔的量加入酶標板，4℃包被12h，用洗滌液洗滌3次；加入封閉液，200uL/孔，4℃封閉12h；甩去封閉液，洗板3次，置于37℃干燥，用鋁箔真空密封。

優選情況下，所述包被緩沖液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液。

優選情況下，所述封閉液為含10％胰蛋白胨的PBS緩沖液。

在本發明的一個優選實施例中，所述酶標二抗采用HRP標記的羊抗兔IgG抗體。

在本發明的一個具體實施例中，其中所述兔抗血清是由O型FMDV基因工程抗原免疫兔子制備。血清抗體經辛酸-硫酸銨法和G蛋白柱法進行初步純化，然后用O型FMDV基因工程抗原和標簽抗原進行親和層析純化，去除了非特異性抗體，抗體純度高。與單克隆抗體相比，所述血清抗體制備簡單、成本低，具有多個抗原表位結合位點，與包被抗原結合能力更強。

本發明的積極效果是：