[發明專利]一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的無標記電化學免疫傳感器的制備方法

有效

• 申請號: 201610211760.6
• 申請日: 2016-04-06
• 公開（公告）號: CN105891483B
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 楊占軍;藍慶春;李娟;胡效亞
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/543;G01N27/327;G01N27/48;B82Y30/00;B82Y40/00
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司32252
• 代理人: 戴朝榮

1.一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的無標記電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，利用粒徑為150-200nm的石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球修飾電極界面固定抗體分子，制備得到無標記電化學免疫傳感器，包括以下步驟：

(1)將石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球超聲分散于二次去離子水中，取石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球懸浮液與殼聚糖溶液等體積混合并超聲分散均勻；再將上述混合溶液與鏈霉親和素溶液等體積混合；

(2)將玻碳電極先用氧化鋁粉拋光，用二次去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉后，然后依次用乙醇和二次蒸餾水超聲清洗玻碳電極，最后在氮氣下吹干；

(3)取步驟(1)中制得的鏈霉素生物功能化的石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的混合溶液滴涂于步驟(2)中所得潔凈的玻碳電極表面，并置于冷藏低溫的環境下晾干；

(4)在步驟(3)所修飾后的玻碳電極表面滴涂生物素化的抗體，室溫下反應后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗；

(5)將牛血清蛋白溶液滴涂于步驟(4)中所得到的玻碳電極表面，在室溫下封閉后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，得到該無標記電化學免疫傳感器；

步驟(1)中，所述聚苯乙烯/石墨烯復合粒子用濃度為2.0～4.0mg/mL，殼聚糖溶液的濃度為1.0～2.0wt％，鏈霉親和素的濃度為400～600μg/mL；步驟(2)中，所述的氧化鋁粉粒徑為0.05mm；

步驟(1)中，向乙醇水溶液加入溶有引發劑偶氮二異丁腈的苯乙烯單體，室溫攪拌、N₂鼓泡后將體系溫度升高至70℃，恒溫恒速預反應2h，再加入甲基丙烯酰氧乙烯氯化銨，在N₂氛圍下繼續反應22h，將產物離心洗滌后得到聚苯乙烯球懸浮液液。將氧化石墨烯懸浮液和聚苯乙烯球懸浮液液混合超聲，加入去離子水，在室溫下攪拌，將體系升溫至95℃，加入水合肼，回流反應，將產物離心洗滌后得到石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球懸浮液，石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球粒徑為150-200nm。

2.如權利要求1所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的無標記電化學免疫傳感器制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述冷藏低溫為4℃；步驟(4)中，所述生物素化的抗體濃度為1～10μg/mL。

3.如權利要求1所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的無標記電化學免疫傳感器制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述牛血清蛋白溶液濃度為1.0～2.0wt％。

4.一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的無標記電化學免疫分析方法，其特征在于，包括如下分析步驟：

a.將如權利要求1所述的基于石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的無標記電化學免疫傳感器在抗原溫育液中溫育，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗；

b.以制得的該無標記電化學免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極作為輔助電極，鉑片電極作為對電極，在鐵氰化鉀測試液中，用差示脈沖伏安法檢測電化學信號。

5.如權利要求4所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的無標記電化學免疫分析方法，其特征在于，步驟a中，溫育時間為30～40min。

6.如權利要求4所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復合納米球的無標記電化學免疫分析方法，其特征在于，步驟b中，鐵氰化鉀測試液由5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和0.1M KCl混合液組成，溶液的pH為6.5，體積為10mL。