[發明專利]一種分離雞胚血來源的原始生殖干細胞的方法

在審

• 申請號: 201610210520.4
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN105779377A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 王丙云;張曉芳;陳志勝;陳勝鋒;計慧琴;李東升;冼瓊珍;劉櫻;馮娜
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 許英偉

1.一種分離雞胚血來源的原始生殖干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)微量玻璃針采血裝置的制備；

(2)14HH雞胚血液的采集；

(3)采集的14HH雞胚血液置入含有BRL-3A細胞飼養層和PGCs完全培養液的培養體系中 培養，原代培養10-15d即可純化細胞；

(4)將純化后PGCs重新置入含有完全培養基的BRL-3A飼養層細胞上進行體外培養擴 增；

(5)對體外培養擴增的PGCs進行間接免疫熒光檢測，包括SSEA-1和DAZL表面標記；

(6)對體外培養擴增的PGCs進行RT-PCR鑒定，鑒定的基因包括Nanog、PouV、SOX2、 DAZL、CVH。

2.根據權利要求1所述一種分離雞胚血來源的原始生殖干細胞的方法，其特征在于，該 微量玻璃針采血裝置由1ml微量注射器、r3603軟管和微量毛細玻璃管三部分組成，微量注 射器和微量毛細玻璃管由r3603軟管相連接，在無菌條件下，將微量毛細玻璃管在酒精燈外 焰上快速拉絲。

3.根據權利要求2所述一種分離雞胚血來源的原始生殖干細胞的方法，其特征在于，所 述微量玻璃針采血裝置的制備包括以下步驟：

(1)將熔點毛細管放入試管內，高壓滅菌；

(2)在凈化工作臺中，兩手捏住熔點毛細管兩端，將熔點毛細管中間部位放入酒精燈火 焰外焰，當看到彎曲熔化現象出現時，快速從火焰上撤離并向兩端抽拉熔點毛細管；

(3)將細絲在中間折斷，細針要在4cm左右方可，將微量玻璃針插在海綿薄墊上備用；

(4)在注射器上安裝r3603軟管，r3603軟管插入微量玻璃針備用。

4.根據權利要求1所述一種分離雞胚血來源的原始生殖干細胞的方法，其特征在于，所 述14HH雞胚血液的采集包括以下步驟：無菌條件下打開蛋殼，將雞蛋置于無菌培養皿中用 眼科鑷子夾斷胚胎背主動脈，使用上述微量玻璃針采血裝置，使用微量玻璃針置于胚胎背 主動脈斷口處，利用虹吸作用吸取血液，再向外抽動注射器，抽取剩余的血液。

5.根據權利要求4所述一種分離雞胚血來源的原始生殖干細胞的方法，其特征在于，所 述14HH雞胚胚血的采集包括以下步驟：

(1)新鮮種蛋孵化到14-17HH，酒精棉球消毒蛋殼，無菌條件下平放雞蛋，小心打開蛋 殼，將雞蛋置于無菌培養皿中；

(2)用眼科鑷夾斷胚體背主動脈，血液會流出至胚體表面；

(3)將連有注射器的微量玻璃針置于血液中，微量玻璃針通過虹吸作用將從血管中涌 出的血液吸入微量玻璃針中，一段時間后向外抽動注射器，抽取剩余的血液；

(4)推動注射器將微量玻璃針中的血液輕輕注射到含PGCs完全培養液的BRL-3A飼養層 中，每枚雞胚取5-10μl血液置于飼養層中。

6.根據權利要求1所述一種分離雞胚血來源的原始生殖干細胞的方法，其特征在于，所 述BRL-3A細胞飼養層的制備包括以下步驟：

(1)取凍存的BRL-3A細胞迅速置入37℃的水浴鍋中，不斷搖晃凍存管，使其在1min鐘內 融化，加入培養基稀釋至4倍左右；

(2)1000rpm離心5min，棄上清。用含10％血清1％雙抗的培養基重懸細胞，轉移至細胞 培養皿中，37℃，5％CO2，培養箱培養；

(3)選擇生長狀況良好、80％-90％匯合的細胞，吸出培養液，用PBS洗滌2次加入含絲裂 霉素-C(10μg/mL)的細胞培養液，37℃孵育2h；

(4)去掉培養液，用PBS洗滌4-6次，以徹底去除絲裂霉素-C；

(5)胰酶消化，使細胞變成單細胞懸液。調整細胞密度為5×10⁵個/mL，接種于6孔板中， 置37℃，5％CO2，培養箱中培養，24h后可使用；

(6)觀察細胞生長情況，發現細胞過稀則補加絲裂霉素-C處理過的細胞，以保證細胞鋪 成單層，能連成一片而沒有間隙；

(7)制備好的飼養層放放入培養箱中備用，使用前換為PGCs培養液；一般制備好的飼養 層在5d內使用。