[發(fā)明專利]用三重復(fù)合免疫捕獲RT-PCR同步檢測(cè)百合三種病毒的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610210127.5
• 申請(qǐng)日: 2016-04-07
• 公開（公告）號(hào): CN105755173B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張玉寶;王亞軍;謝忠奎;王若愚;郭志鴻;楊果;邱陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所;徐州沐陽(yáng)生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6804
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明提供了一種免疫捕獲三重RT?PCR同步檢測(cè)百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病毒的方法，其步驟包括在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中用LSV、LMoV和CMV的多克隆抗體特異性捕獲LSV、LMoV和CMV粒子、利用LSV、LMoV和CMV的特異性引物進(jìn)行三重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT?PCR、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段；該方法將ELISA和RT?PCR結(jié)合，對(duì)現(xiàn)有的免疫捕獲RT?PCR進(jìn)行了改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了用免疫捕獲RT?PCR同步檢測(cè)三種百合病毒LSV、LMoV和CMV，從而完善了免疫捕獲RT?PCR技術(shù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種同步檢測(cè)百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病毒的方法，更進(jìn)一步涉及一種用免疫捕獲三重RT-PCR技術(shù)同步檢測(cè)百合隱癥病毒、斑駁病毒和黃瓜花葉病毒的方法。

背景技術(shù)

百合病毒自20世紀(jì)40年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已成為危害百合種球生產(chǎn)和鮮切花品質(zhì)的世界性病害；至今被發(fā)現(xiàn)侵染百合病毒有20多種，其中百合隱癥病毒(Lily symptomlessvirus，LSV)、百合斑駁病毒 (Lily mottle virus，LMoV)和黃瓜瓜花葉病毒（Cucumbermosaic virus, CMV）是發(fā)生較普遍、危害嚴(yán)重的3種病毒。

LSV屬于香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)，是正義單鏈 RNA 病毒；LSV 基因組為不分段 RNA，全長(zhǎng)為 8394 bp，5′端含帽子結(jié)構(gòu)，3′端有polyA 尾巴，共有 6 個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼 4 個(gè)蛋白，依 5′至 3′分別編碼：RNA 依賴的 RNA 聚合酶(RdRp)，三基因連鎖結(jié)構(gòu)(TGBp1-3)，外殼蛋白(CP)和核酸結(jié)合蛋白；LSV的ORF1為RdRp，編碼一個(gè)蛋白(220kD)，與病毒在植物體內(nèi)復(fù)制有關(guān)；ORF2、ORF3 和 ORF4 分別編碼 TGBp1、TGBp2 和 TGBp3(25 kD，12 kD，7 kD)，是病毒在宿主體內(nèi)運(yùn)動(dòng)的 3 個(gè)基因序列互相重疊的運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)；ORF5為CP，編碼唯一參與病毒顆粒形態(tài)構(gòu)成的蛋白質(zhì)(32kD)；ORF6推測(cè)是核酸結(jié)合蛋白(16kD)，該蛋白含有一個(gè)CysZ-CysZ結(jié)構(gòu)的鋅指結(jié)構(gòu)域。

LMoV屬于馬鈴薯Y病毒科、馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），病毒粒子為彎曲線狀且呈螺旋對(duì)稱，大小（650～900）nm ×（11～15）nm；病毒基因組為單分子正鏈RNA，約9.4kb，具有potyvirus屬成員的典型基因組結(jié)構(gòu)特征，包括一個(gè)Poly（A）尾巴，編碼一個(gè)由3095個(gè)氨基酸組成的分子量為351.0 kDa的多聚蛋白；多聚蛋白通過自我剪切后形成外殼蛋白（CP）等10個(gè)不同大小的功能蛋白；LMoV CP亞基由274 aa組成，大小為30kDa左右，組裝成外殼包裹病毒RNA。

CMV是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員，在世界范圍內(nèi)均有分布，宿主范圍遍布于雙子葉植物和單子葉植物，已經(jīng)闡明的就多達(dá)1000種以上；CMV病毒顆粒分子量在5000～67000kDa之間，病毒體RNA含量占18%，蛋白質(zhì)含量82%，衣殼蛋白分子量為24.5KDa；A260/A280大約1.7；病毒顆粒為正20面體球狀，直徑28～30nm；RNA由四條RNA分子組成，RNA1和RNA2 被分別包被，RNA3和RNA4則被包被于同一衣殼中。