[發(fā)明專(zhuān)利]一種可對(duì)依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行定性和定量分析的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610209936.4
• 申請(qǐng)日: 2016-04-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107271526B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康經(jīng)武;張明瑜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): G01N27/447
• 分類(lèi)號(hào): G01N27/447
• 代理公司: 上海海頌知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31258
• 代理人: 何葆芳

1.一種可對(duì)依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行定性和定量分析的方法，其特征在于，包括如下步驟：

a)利用抗凝血酶III的親和色譜柱對(duì)依諾肝素鈉樣品按親和活性進(jìn)行分離并制備成多個(gè)不同親和活性的組分；所述的抗凝血酶III的親和色譜柱的制備包括如下步驟：①使過(guò)量的依諾肝素鈉樣品與抗凝血酶III進(jìn)行孵育，以激活抗凝血酶III并占據(jù)其活性位點(diǎn)；②使活性位點(diǎn)被保護(hù)的抗凝血酶III以共價(jià)鍵固定到色譜柱內(nèi)的水化填料上；其中，依諾肝素鈉與抗凝血酶III的質(zhì)量比為2.5:1～5:1；進(jìn)行孵育的緩沖溶液的pH為8.0～8.5、是由150～250mmol/L的碳酸氫鈉溶液與450～550mmol/L的氯化鈉溶液形成；1毫升水化填料中含抗凝血酶III的質(zhì)量≤5毫克；

b)用混合肝素酶對(duì)依諾肝素鈉樣品及步驟a)所制備的多個(gè)不同親和活性的組分分別進(jìn)行完全酶解；

c)對(duì)步驟b)所得到的每一個(gè)完全酶解產(chǎn)物分別進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離分析；

d)根據(jù)公式：計(jì)算步驟c)所分離的各個(gè)成分的電泳淌度，其中：L_T和L_D分別是毛細(xì)管的總長(zhǎng)和有效長(zhǎng)度，V為分離電壓，t為遷移時(shí)間；

e)結(jié)合寡糖的電荷質(zhì)量比與電泳淌度之間的如下線(xiàn)性關(guān)系：對(duì)每一個(gè)完全酶解產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖中的分離峰所對(duì)應(yīng)的酶解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，以定性確定出五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰；其中：Z/M為寡糖電荷質(zhì)量比，μ為對(duì)應(yīng)的電泳淌度；

f)根據(jù)所確定的五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰的峰面積，采用面積百分?jǐn)?shù)歸一化方法，定量計(jì)算出五糖結(jié)構(gòu)單元的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的水化填料是由NHS或CNBr官能團(tuán)化的瓊脂糖。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)利用抗凝血酶III的親和色譜柱制備不同親和活性組分的步驟包括：

Ⅰ)洗脫抗凝血酶III所結(jié)合的依諾肝素鈉；

Ⅱ)平衡色譜柱；

Ⅲ)上樣；

Ⅳ)進(jìn)行梯度洗脫和色譜分離。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述抗凝血酶III為野生型或重組型。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟Ⅰ)采用含有1.5～4.0mol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行洗脫。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟Ⅱ)采用含有5～30mmol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行平衡10～20分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟Ⅲ)先采用含有5～30mmol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液溶解樣品，配制成濃度為10～140mg/mL的樣品溶液，然后以進(jìn)樣量為1～30μL進(jìn)行上樣。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟Ⅳ)進(jìn)行梯度洗脫的條件為：

0～15分鐘：A相為100％，B相為0；

15～20分鐘：A相為65％～75％，B相為25％～35％；

20～35分鐘：A相為0％，B相為100％；

所述的A相為含有5～30mmol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液，所述的B相為含有1.5～4.0mol/L氯化鈉的Tris-HCl緩沖溶液。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟Ⅳ)進(jìn)行色譜分離的條件為：

流動(dòng)相為pH7.0～8.0、濃度為5～20mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液；

分離時(shí)，流動(dòng)相和色譜柱均保持1～15℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)為紫外230～235nm。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟b)中所述的混合肝素酶包括肝素酶I，肝素酶II和肝素酶III中的至少兩種。