[發明專利]用于蛋白質質譜在線分析的PMMA芯片及其制備方法

有效

• 申請號: 201610207933.7
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN105879938B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 胡賢巧;盧林;朱智偉;方長云;段彬伍;于永紅;何小嫣
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: B01L3/00
• 分類號: B01L3/00;G01N33/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明涉及在芯片加工領域中的一種利用微細加工和化學修飾手段制備集成有微型通道、固定化酶反應器、電噴霧噴嘴和電極的，可與質譜聯用的蛋白質分析芯片的方法。

背景技術

蛋白質組學研究是21世紀生命科學的研究熱點之一。生物質譜由于其可以提供試樣組份中生物大分子的基本結構和定量信息，因此在蛋白質研究中具有巨大的潛力。進入質譜檢測前，蛋白質必須先進行酶解處理，這個前處理是必不可少的。在傳統蛋白質分析中，蛋白質先經過常規的溶液中酶解，然后收集酶解液進質譜檢測分析。常規溶酶解蛋白質的反應時間長，一般需要十幾個小時以上，且存在嚴重的酶自降解現象。這大大阻礙了蛋白質的快速有效分析。

微流控芯片可以集成常規分析系統中的試樣引入、預處理、反應、分離、檢測等眾多功能單元，具有微型化、集成化、自動化、便攜化等眾多優點，越來越受到各界的關注。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)由于其光學性能好、生物兼容性好、玻璃化溫度較低、加工方便成本低等優勢而被廣泛地用于制作各種微流控芯片。

微流控芯片由于其通道特性，在通道內反應速度較常規溶液中快。因此，芯片通道內的酶解可以很大程度地減小酶解時間。此外，將蛋白酶固定在通道表面，可以提高酶與底物的接觸面積，從而大大提高了酶解反應效率，實現快速酶解。因此，文獻中有報道將胰蛋白酶固定在通道表面，然后蛋白質樣品通入芯片酶解后直接與基質混合轉移至MALDI板上進行檢測，大大縮短了酶解時間，實現了自動快速酶解。但可以看出，實驗過程中仍需收集酶解液進行離線檢測，蛋白質酶解和質譜檢測這兩個步驟仍是獨立依次進行，耗時耗力，不能實現在線快速自動酶解、在線質譜檢測。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種用于蛋白質質譜在線分析的PMMA芯片及其制備方法，采用本發明的方法能得到集成有微型通道、固定化酶反應器、電噴霧噴嘴和電噴霧電極的，可與ESI質譜直接聯用進行蛋白質分析的PMMA芯片。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種用于蛋白質質譜在線分析的PMMA芯片的制備方法，包括以下步驟：

1)、在PMMA基片的正面集成微型通道，得帶有通道的PMMA基片；所述微型通道的末端通道與PMMA基片的中心線相重合；

2)、在PMMA蓋片的正面集成電噴霧電極，得帶有電極的PMMA蓋片；

所述電噴霧電極包括2個電極塊和一根電極線，所述2個電極塊分別位于PMMA蓋片的中心線的兩端，且2個電極塊通過電極線相連通；

3)、將帶有通道的PMMA基片以末端通道(即，PMMA基片的中心線)為角平分線切割形成尖角；

將帶有電極的PMMA蓋片切割形成與PMMA基片的尖角相吻合的尖角；

4)、將步驟3)所得的切割后PMMA基片和切割后PMMA蓋片均置于紫外燈下，進行紫外光輻射處理；

5)、將步驟4)所得的輻射處理后PMMA基片和輻射處理后PMMA蓋片進行封合，得PMMA芯片；PMMA基片的正面與PMMA蓋片的正面相貼合(即，通道面與電極面相貼合)，PMMA基片的中心線與PMMA蓋片的中心線相重合，形成PMMA基片尖角的兩個斜面與形成PMMA蓋片尖角的兩個斜面相對應的吻合，所述電極線垂直橫跨末端通道；

打磨PMMA芯片的尖角(由PMMA基片尖角和PMMA蓋片尖角組合形成)，使尖角處的PMMA芯片的厚度為0.65～0.75mm，PMMA芯片尖端設置電噴霧噴嘴；所述電噴霧噴嘴與末端通道相連通；

所述電極線與末端通道的交叉點距離電噴霧噴嘴(4)0.45～0.55cm；

6)、先向微型通道內充滿乙二胺溶液，室溫反應2～3小時，反應結束后用純凈水沖洗微型通道；

再向微型通道(1)內充滿戊二醛溶液，室溫反應10～16小時，反應結束后用用50mmol/L pH＝7.0的磷酸緩沖液沖洗微型通道；

最后向微型通道內充滿蛋白酶溶液，3～5℃下反應22～26h(較佳為4℃下反應24h)，反應結束后用純凈水沖洗微型通道；得用于蛋白質質譜在線分析的PMMA芯片。

備注說明：該用于蛋白質質譜在線分析的PMMA芯片為集成有微型通道、固定化酶反應器、電噴霧噴嘴和電噴霧電極的，可與ESI質譜直接聯用進行的PMMA芯片。

在步驟4)中，PMMA基片和PMMA蓋片經紫外光輻射處理后，表面會產生羧基等基團；羧基與乙二胺溶液反應，微型通道的表面修飾上氨基基團；氨基基團與戊二醛溶液反應，微型通道的表面修飾上醛基基團；蛋白酶與微型通道表面的醛基反應從而修飾到微型通道的表面。