[發(fā)明專利]P1NP檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610207318.6
• 申請日: 2016-03-31
• 公開（公告）號: CN105759055A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭志程
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州菲康生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體地是涉及一種人血清或血漿中I型膠原氨基端延長肽(P1NP)檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

I型膠原前肽(P1NP)是最常見的骨膠原，是骨基質(zhì)的重要組成部分，幾乎占總蛋白部分的90％。在骨中的膠原是由成骨細(xì)胞以前膠原的形式合成的，前膠原形成膠原纖維時從前膠原分子上裂解產(chǎn)生前膠原氨基端肽(P1NP)，因此，測定其在血中的水平，可反映骨形成情況。

P1NP反映的是I型膠原的沉積情況，因此是作為一項(xiàng)骨形成標(biāo)志物。在I型膠原的形成過程中，P1NP被釋放至細(xì)胞外間隙最終進(jìn)入血液。所以，血清中I型膠原前肽水平在一定范圍內(nèi)是反映成骨細(xì)胞活動和骨形成以及反映I型膠原合成速率的特異指標(biāo)。

另一方面，現(xiàn)有的檢測手段存在諸多缺陷：檢測成本較高，使用不方便，無法實(shí)現(xiàn)快速檢測，測試的靈敏度也比較低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種人血清或血漿中I型膠原氨基端延長肽試劑盒。

實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案如下：

一種人血清或血漿中I型膠原氨基端延長肽(P1NP)檢測試劑盒，主要包括：

1)包被有鏈霉親和素的微孔板，每個微孔包被的鏈霉親和素量為0.24－0.36μg；

2)生物素標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體溶液，其中P1NP單克隆抗體的濃度為0.8－1.2μg/ml，用量為每微孔100μl；

3)HRP標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體溶液，其中HRP標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體的工作濃度為1:2500-3000。

在其中一個實(shí)施例中，每個微孔包被的鏈霉親和素量的為0.3μg。

在其中一個實(shí)施例中，生物素標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體得濃度為1.0μg/ml。

本發(fā)明另一目的是提供一種P1NP檢測試劑盒的制備方法。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案為：

一種P1NP檢測試劑盒的制備方法，主要包括以下步驟：

1)包被有鏈霉親和素的微孔板：

向每個微孔板的微孔中加入80－120μl濃度為3μg/ml的鏈霉親和素，37±2℃干燥，密封保存，洗板，封閉；

2)制備生物素標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體溶液：將鼠抗P1NP抗體用PBS緩沖液和EDTA稀釋至終濃度為2mg/ml，然后加入NH₂-ReactiveBiotin使體積為0.5ml，輕輕混勻后置于37±2℃恒溫箱中避光溫育，離心，再用10mmol/L的PBS緩沖液和25mol/L的EDTA稀釋至終濃度為0.8－1.2μg/ml。

優(yōu)選地，所述每個微孔中加入鏈霉親和素的量為100μl。

優(yōu)選地，所述微孔板的洗板和封閉為：加入鏈霉親和素的次日，棄去孔內(nèi)液體，加入洗滌液280-300ul/孔，漂洗3次，每次3min；按200-250ul/孔加入封閉液，37±2℃封閉1-2小時或在4℃封閉過夜，然后棄去孔內(nèi)封閉液。

所述P1NP檢測試劑盒還包括有HRP標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體，該HRP標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體抗體的制備操作為：

1)取鼠抗P1NP單克隆抗體凍干粉0.1g，與10ml濃度為10mmol/L的PBS緩沖液混合；

2)取HRP干粉用去離子水稀釋為5mg/ml，采用簡易過碘酸鈉法將HRP與抗體交聯(lián)；

3)取制備后的HRP標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體，用10mmol/L的PBS緩沖液和25mol/L的EDTA稀釋，稀釋后的HRP標(biāo)記的鼠抗P1NP單克隆抗體的工作濃度為1:2500－3500，加入防腐劑和穩(wěn)定劑后保存。

所述鼠抗P1NP單克隆抗體的制備為：取6只小白鼠，采用皮下注射方式進(jìn)行免疫接種，初次免疫注射1mg/mLP1NP抗原0.2ml/只，第3周、第4周及第5周注射1mg/mLP1NP抗原與不完全弗氏佐劑等體積混合溶液0.4ml/只；第5周后取血檢測效價，若大于1：10000，則拉頸處死小鼠后取脾臟，然后采用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。

所述P1NP檢測試劑盒采用酶聯(lián)免疫法，基于抗P1NP抗體對可溶性P1NP抗原雙抗夾心法檢測原理設(shè)計(jì)。所述P1NP檢測試劑盒具有特異性、靈敏度和精密度都非常好的優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式