[發明專利]基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒及使用方法

有效

• 申請號: 201610206835.1
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN105647910B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 吳巧;張佳斌;曲峰;尚春慶
• 申請（專利權）人: 蘇州英芮誠生化科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

1.一種基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，包括有分別獨立分裝的除雜磁珠懸浮液、提取磁珠懸浮液、細菌裂解液、結合緩沖液、清洗液和洗脫液；

其中，所述除雜磁珠懸浮液中分散有除雜磁珠，所述除雜磁珠表面至少修飾有苯乙烯、二乙烯基苯和亞氨基二乙酸；

所述提取磁珠懸浮液中分散有提取磁珠，所述提取磁珠表面修飾有硅羥基；

所述除雜磁珠的制備方法如下：

S1：將1-5份的包裹SiO₂的四氧化三鐵納米磁球加入到含800份乙醇和200份水的混合體系中，加入0.1-1份三乙胺，在惰性氣體保護下，升溫至40-80℃，隨后加入0.5-5份硅烷偶聯劑KH570，攪拌反應4-6小時，經清洗干燥后，得到修飾有KH570的磁珠；

S2：取1-5份修飾有KH570的磁珠加入到1000份DMSO溶液中，加入0.5-1份的苯乙烯、0.2-1份的二乙烯基苯、1-2份的丙烯醇和0.05份的偶氮二異丁腈，升溫至60-85℃，惰性氣體保護下，攪拌反應4-6小時，加入0.5-1.5份的甲基丙烯酸縮水甘油酯，繼續攪拌反應12-16小時，經洗滌干燥后，得到改性磁珠；

S3：取1-5份所述改性磁珠分散到1000份的含有0.2M的碳酸鈉水溶液中，加入1-3份的亞氨基二乙酸，反應2-4小時，經洗滌干燥后，即得到除雜磁珠；

所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括：

步驟1)菌液準備：取細菌培養液1.0-2.0份，轉移到孔板中，并記錄；

步驟2)菌體裂解：向孔板中加入0.1-0.2份的細菌裂解液，混勻；

步驟3)質粒復性：向孔板中加入0.2-0.4份的除雜磁珠懸浮液，混勻；

步驟4)去除菌體基因組和蛋白：磁性分離棄去除雜磁珠及其吸附物，保留孔板中澄清透明的菌液；

步驟5)質粒DNA結合：向菌液中加入0.5-1.5份的結合緩沖液以及0.03-0.08份的提取磁珠懸浮液，混勻，磁性分離，去除上層清液；

步驟6)清洗：向孔板中加入0.4-0.8份清洗液，混勻，磁性分離，去除上層清液；

步驟7)除醇和洗脫：將上述含有提取磁珠的孔板放入40℃的真空干燥箱干燥5-10min，隨后加入0.04-0.1份的洗脫液，混勻，磁性分離去除磁珠，在孔板的洗脫液中即含有目標質粒DNA。

2.如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述除雜磁珠懸浮液包括有3-6mg/mL的除雜磁珠和第一分散液，所述第一分散液包括有1-3M的無機酸、2-4M的金屬鹽、0.02-0.05M的Tris-HCl緩沖液和0.1-0.2mg/mL的RNA酶；所述無機酸選自硫酸、鹽酸、硝酸或其組合；所述金屬鹽選自碳酸鉀、醋酸鉀、碳酸鈉、醋酸鈉或其組合。

3.如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述提取磁珠懸浮液包括有40-60mg/mL的提取磁珠和第二分散液，所述第二分散液包括有0.1-0.5M的氯化鈉；且所述第二分散液的pH為5.0-7.4。

4.如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述細菌裂解液包括0.2-1.5M的氫氧化鉀、0.15-0.5wt％的十二烷基硫酸鈉和0.01-0.025M的乙二胺四乙酸。

5.如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述結合緩沖液包括0.01-0.03M的尿素、0.08-0.15M的醋酸鈉、0.2-1wt％的β-巰基乙醇、4-6.5M的第一變性劑，所述第一變性劑選自鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鉀、碘化鈉或其組合。

6.如權利要求1所述的基于雙磁珠法免離心提取質粒DNA的試劑盒，其特征在于，所述清洗液包括38-72wt％的異丙醇，0.8-1.6M的第二變性劑，所述第二變性劑選自鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鉀或其組合。