[發(fā)明專利]一種耐鹽性蛋白酶的提取及縮短魚露發(fā)酵時(shí)間的應(yīng)用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610205362.3
• 申請(qǐng)日: 2016-04-05
• 公開（公告）號(hào): CN105754975A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高向陽;謝莉;肖運(yùn)柱;陳瑜珠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/58
• 分類號(hào): C12N9/58;C12N1/14;A23L27/50;C12R1/80
• 代理公司: 張家界市慧誠商標(biāo)專利事務(wù)所 43209
• 代理人: 高紅旺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及到酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種耐鹽性絲氨酸類蛋白酶的提取并利用其縮短魚露發(fā)酵時(shí)間的方法。

背景技術(shù)

魚露是我國傳統(tǒng)水產(chǎn)調(diào)味品，是以經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低的魚蝦及水產(chǎn)品加工的下腳料為原料，主要利用魚體自身含有的蛋白酶及其他酶，以及在多種耐鹽和嗜鹽微生物在一定條件下共同作用所形成的。但目前我國魚露的傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)缺乏完善的質(zhì)量評(píng)估與控制體系，其生產(chǎn)工藝與技術(shù)也有待于改進(jìn)。而且在天然環(huán)境下，魚體分解較慢，一般添加飽和食鹽，這種高鹽環(huán)境抑制腐敗微生物生長(zhǎng)。因此，在高鹽環(huán)境下縮短發(fā)酵時(shí)間，進(jìn)行快速發(fā)酵一直是魚露發(fā)酵工藝的研究重點(diǎn)。

國內(nèi)外對(duì)魚露的快速發(fā)酵的研究除保溫發(fā)酵、外加酶發(fā)酵及復(fù)合發(fā)酵外，一些研究員將目光集中在魚露發(fā)酵液中的微生物篩選及應(yīng)用。泰國學(xué)者在2008年又從發(fā)酵一個(gè)月的泰國魚露中分離到virgibacillussp.SK33（Sinsuwanetal.,2008）。日本研究者2004年從越南魚露中分離出能在大豆蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大量的堿性蛋白酶的菌株BacillussubtilisCN2（Uchidaetal.,2004）。在國內(nèi)，研究學(xué)者從自制發(fā)酵3個(gè)月的魚露中篩選出具有降解生物胺能力的菌株奧默柯達(dá)酵母M8（楊利昆等，2012）；而且從傳統(tǒng)發(fā)酵的潮汕魚露中分離出乳酸菌（張豪等，2013）。目前越來越多的學(xué)者從魚露中分離得到一些嗜鹽性的和耐鹽性的微生物包括Bacillussp.,Pseudomonassp.,Filobacillussp.,Micrococcussp.,Staphylococcussp.,Virgibacillussp.,Halobacillussp.,Halococcussp.,H.salinarum,Halobacteriumcutirubrum，H.salinarium（KawasakiFukamietal.,2004；Akolkaretal.,2010；Lopetcharatetal.,2001；Namwongetal.,2006；Hiragaetal.,2005）。今后魚露快速發(fā)酵的另一個(gè)研究重點(diǎn)是從傳統(tǒng)魚露的發(fā)酵過程中分離篩選出耐鹽和嗜鹽高產(chǎn)蛋白酶微生物，鑒定其蛋白酶的性質(zhì)，并進(jìn)行魚露快速發(fā)酵的研究，找到既能顯著縮短魚露發(fā)酵周期，又能產(chǎn)生良好風(fēng)味的菌種，并使其能應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。但是目前仍未見耐鹽和嗜鹽高產(chǎn)蛋白酶微生物應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中取得較好效果的報(bào)道，更鮮有報(bào)道Penicilliumcitrinum及所產(chǎn)的耐鹽性蛋白酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供耐鹽性絲氨酸類蛋白酶的提取方法及其添加到魚露發(fā)酵中可縮短發(fā)酵時(shí)間的應(yīng)用，其采用從魚露發(fā)酵液中篩選的產(chǎn)耐鹽性蛋白酶的橘青霉菌菌株，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵提取得到耐鹽性絲氨酸類蛋白酶，其具有較好的耐鹽性，用于魚露發(fā)酵可以縮短發(fā)酵時(shí)間，而且風(fēng)味與自然發(fā)酵的魚露高級(jí)產(chǎn)品的風(fēng)味相似，不會(huì)產(chǎn)生不良風(fēng)味。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種耐鹽性絲氨酸類蛋白酶的提取方法，是利用從魚露發(fā)酵液中篩選出的PenicilliumcitrinumYL-1進(jìn)行發(fā)酵，得到的粗酶液再經(jīng)硫酸銨沉淀、透析和DEAEcellulose-52離子交換柱層析而得到。所述PenicilliumcitrinumYL-1的篩選方法包括以下步驟：

（1）按以下重量份的配比配制分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200份，葡糖糖20份，NaCl100份，瓊脂20份；

（2）取魚露發(fā)酵液用無菌水中稀釋10倍，依次按十倍級(jí)差稀釋，取不同的稀釋度樣液，分別涂布分離培養(yǎng)基培養(yǎng)的分離平板，同一稀釋度重復(fù)三個(gè)平板，然后倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h觀察一次；

（3）采用平板透明圈法進(jìn)行菌株初篩，所用培養(yǎng)基為含脫脂乳的固體培養(yǎng)基，初步篩選出產(chǎn)蛋白酶菌株；

（4）將分離得到的霉菌菌株選擇生長(zhǎng)良好、形態(tài)明顯的單菌落，點(diǎn)種于脫脂乳培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5d后，通過其水解圈篩選產(chǎn)蛋白酶菌株，接種到斜面培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)好后放入4℃冰箱冷藏。

更為具體的實(shí)施方案為：一種耐鹽性絲氨酸類蛋白酶的提取方法，包括以下步驟：

a、按重量百分比KH₂PO₄0.2%、MgSO₄·7H₂O0.2%,NaCl10%混合配成1000mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)pH至5.5，然后每只250mL三角瓶中稱取6g干麩皮，加入9mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻，用121℃，20min高溫濕熱滅菌，得基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基；