[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)黃瓜棒孢葉斑病抗性位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610204267.1
• 申請(qǐng)日: 2016-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105603119A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王惠哲;曹明明;鄧強(qiáng);李淑菊;楊瑞環(huán);劉耕春
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專(zhuān)利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，提供了黃瓜棒孢葉斑病抗性的SNP標(biāo) 記及其鑒定方法。可用于黃瓜棒孢葉斑病抗性的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。

背景技術(shù)

黃瓜(CucumisSativusL.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(Cucumis)一年蔓生草本 植物，是全球普遍栽培的主要蔬菜作物，是中國(guó)栽培面積最大、種植范圍最廣的主要蔬菜作 物之一。黃瓜棒孢葉斑病[Cucumbertargetleafspot]，又稱(chēng)“褐斑病”、“靶斑病”、“黃點(diǎn)子病”， 是一種世界性分布的真菌病害，近年來(lái)在我國(guó)嚴(yán)重暴發(fā)，是公認(rèn)的危害黃瓜生產(chǎn)的一種僅次 于霜霉病的病害，已成為制約黃瓜生產(chǎn)的關(guān)鍵病害。黃瓜棒孢葉斑病在溫室、露地都有發(fā)生， 且有不斷加重的趨勢(shì)，一旦發(fā)生常造成嚴(yán)重?fù)p失甚至毀園。北方地區(qū)以春、秋及越冬保護(hù)地 栽培發(fā)生普遍，南方則以春、秋露地發(fā)生較多。一般病田發(fā)病率為10％～25％，嚴(yán)重時(shí)可達(dá) 60％～70％，甚至100％，給種植戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。尤其在蔬菜高度產(chǎn)業(yè)化的今天，基于 傳統(tǒng)的抗病育種模式嚴(yán)重制約著黃瓜品種的更新?lián)Q代、生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化的步伐，利用現(xiàn)代生物技 術(shù)手段進(jìn)行黃瓜抗病分子標(biāo)記輔助育種勢(shì)在必行。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和遺傳標(biāo)記的應(yīng)用和發(fā)展，為蔬菜育種學(xué)開(kāi)辟了嶄新的研究和應(yīng)用 領(lǐng)域，它使蔬菜育種學(xué)家能直接從分子水平了解物種間的差異,也使育種過(guò)程更直觀，目的性 更強(qiáng)。分子標(biāo)記輔助選擇(Molecularmarker-assistedselection，MAS)技術(shù)目前已成為育種研 究的熱點(diǎn)和重要手段，將分子遺傳技術(shù)應(yīng)用于蔬菜抗病遺傳育種的研究上，為材料的選擇提 供了全新的手段。可在早代對(duì)表現(xiàn)優(yōu)良的基因型進(jìn)行直接選擇，苗期即可在DNA水平上對(duì)目 標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，抗病性鑒定可在室內(nèi)完成，鑒定周期縮短到2天，而且穩(wěn)定可靠，不受季 節(jié)、環(huán)境條件等因素的影響，可提高選擇速度，增強(qiáng)選擇的準(zhǔn)確性和可靠性，加快育種進(jìn)程， 因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

隨著蔬菜集約化生產(chǎn)和栽培技術(shù)的提高，黃瓜抗病育種已提到重要位置。黃瓜棒孢葉斑 病是黃瓜生產(chǎn)上的重要病害。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，迄今為止，有關(guān)黃瓜棒孢葉斑病的SNP分子 標(biāo)記輔助育種研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因而將黃瓜抗棒孢葉斑病基因與不抗棒孢葉斑病的其它 品種的優(yōu)良品質(zhì)基因相結(jié)合，培育優(yōu)良抗病的黃瓜新品種和創(chuàng)造黃瓜新種質(zhì)是生產(chǎn)實(shí)踐中亟 需解決的實(shí)際問(wèn)題。篩選與黃瓜抗棒孢葉斑病基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記，建立黃瓜抗棒孢葉 斑病分子標(biāo)記輔助育種體系，將會(huì)推動(dòng)傳統(tǒng)的“經(jīng)驗(yàn)育種”向高效的“精確育種”轉(zhuǎn)變，提升育 種效率和技術(shù)水平，加速抗病育種的進(jìn)程，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了用于檢測(cè)黃瓜棒孢葉斑病抗性的引物。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于檢測(cè)黃瓜棒孢葉斑病抗性位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

用于檢測(cè)黃瓜棒孢葉斑病抗性的引物，由SEQIDNo.1所示的正向引物，和SEQIDNo.2 所示的反向引物組成。

用于檢測(cè)黃瓜棒孢葉斑病抗性位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法，包括如下步驟：

(1)提取被檢測(cè)樣品黃瓜基因組DNA；

(2)以所述黃瓜基因組DNA為模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所述核苷酸序列 為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得319bp核苷酸序列，所述序列中包含四個(gè)與黃瓜棒孢 葉斑病抗病性相關(guān)基因緊密連鎖的SNP位點(diǎn)或四個(gè)與黃瓜棒孢葉斑病感病性相關(guān)基因緊密連 鎖的SNP位點(diǎn)；

(3)將步驟(2)獲得的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序，如果測(cè)序結(jié)果如SEQIDNo.3所示，為抗 棒孢葉斑病資源；如測(cè)序結(jié)果如SEQIDNo.4所示或同時(shí)具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所述 的核苷酸序列，為感棒孢葉斑病資源。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單高效，結(jié)果可靠；所提供的分子標(biāo)記可用于黃瓜棒孢葉斑病抗性的分 子輔助選擇育種，可以為通過(guò)基因工程改良黃瓜品種的抗病性奠定基礎(chǔ)，并為完善黃瓜分子 育種技術(shù)平臺(tái)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是利用鑒定黃瓜棒孢葉斑病抗性的方法獲得的與黃瓜抗棒孢葉斑病基因緊密連鎖的 SNP標(biāo)記和基因片段及感棒孢葉斑病基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記和基因片段的比對(duì)圖：