[發明專利]體外重組人體皮膚表皮模型及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201610204148.6
• 申請日: 2016-04-01
• 公開（公告）號: CN105734009B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 李瀟;盧永波
• 申請（專利權）人: 廣東博溪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種體外重組人體皮膚表皮模型的制備方法，由下述步驟組成：

(1)制備基質膠微粒

將基質膠用無血清表皮細胞培養基稀釋至50～150μg/mL，置于36～37℃、5％CO₂培養箱，孵育2～4小時，基質膠溶液形成膠顆粒逐漸沉降，棄去未凝固的基質膠，重復該步驟3次，得基質膠顆粒，將基質膠顆粒置于真空干燥箱中進行冷凍干燥，制備成基質膠微粒；

(2)篩選擴增表皮干細胞

將離體的人皮膚組織浸沒于1.2U/mL的質量分數為1％的Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小時，放入37℃胰酶消化液中，37℃消化8～10分鐘，無菌條件下用200目篩網過濾，離心，收集細胞，制備成3×10³個/ml～5×10³個/ml的細胞懸液，細胞懸液與基質膠微粒按質量體積比為5：1混合，置于10ml的旋轉培養系統進行微重力旋轉培養，轉速為22轉/分，旋轉培養20分鐘，棄去培養液，得表皮干細胞，將新鮮的基質膠微粒與無血清表皮細胞培養液按質量體積比為5:1混合，制備成表皮干細胞擴增液，表皮干細胞在表皮干細胞擴增液中培養5～7天，隔天換液，完成表皮干細胞的擴增；

上述100mL的胰酶消化液中含0.025g胰酶、0.01g的乙二胺四乙酸；

(3)制備基底細胞層

將表皮干細胞從基質膠表面用胰酶消化液消化，用培養液TU1進行重懸，接種于細胞小室中，接種密度為0.2×10⁵～0.5×10⁵個/cm²，在細胞小室內液下培養，置于5％CO₂、36～37℃的細胞培養箱中孵育24～48小時，制備成下表面具有一層半橋粒蛋白的基底細胞層；

上述培養液TU1為：在500mLFAD基礎液中添加表皮生長因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、轉鐵蛋白2.5～6μg、角質形成細胞生長因子0.5～5μg，該基礎液用F12與培養液DMEM的體積比為1:3混合配制；

(4)制備棘細胞層

將步驟(3)中的培養液TU1替換為培養液TU2,在含有基底細胞層的細胞小室內添加150～200μl培養液TU2，在36～37℃、5％CO₂、95％相對濕度的細胞培養箱中孵育24～48小時，制備成6～8層具有短凸起的棘細胞層；

上述培養液TU2為：在500mLFAD基礎液中添加表皮生長因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、轉鐵蛋白2.5～6μg、角質形成細胞生長因子0.5～5μg、胰島素1-10mg、L-肉堿0.001～0.1mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化鈣0.03～0.2mM，FAD基礎液用F12與培養液DMEM的體積比為1:3混合配制；

(5)制備顆粒細胞層

替換步驟4中的培養液TU2為培養液TA1，棄去步驟4中細胞小室內的TU2液體，進行氣液面培養，36～37℃、5％CO₂、95％相對濕度的細胞培養箱中孵育72～96小時，48小時更換新鮮的培養液TA1，制備成由3～4層含有透明顆粒的細胞構成的顆粒細胞層；

上述培養液TA1為：500mLFAD基礎液中添加表皮生長因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、轉鐵蛋白2.5～6μg、胰島素1～10mg、氫化可的松10～100μg、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化鈣0.03～0.2mM、L-絲氨酸0.01～0.1mM、棕櫚酸0.01～0.05mM、油酸0.01～0.05mM、精氨琥珀酸0.05～0.1mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化鈣1.0～1.5mM、維生素C15～25μg，該FAD基礎液用F12與培養液DMEM的體積比為1:3混合配制；

(6)體外重組表皮模型的成熟與角化

將步驟(5)中的培養液TA1更換為培養液TA2，進行氣液面培養，置于33～35℃、5％CO₂、95％相對濕度的細胞培養箱中培養4～5天，48小時更換新鮮的培養液TA2；制備成厚度為100～150μm的體外重組人體皮膚表皮模型；

上述培養液TA2為：在500mLFAD基礎液中添加表皮生長因子0.5～5μg、胰島素1～10mg、氫化可的松10～100μg、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化鈣1.0～1.5mM、維生素C10～15μg、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子5～10μg，該FAD基礎液用F12與培養液DMEM的體積比為1:3混合制成。